缺氧时缺氧诱导因子1α在胃癌细胞的表达及其同细胞增殖凋亡的关系(1)-找论文网

【摘要】 　　目的研究缺氧诱导因子1α（hypoxiainducible factor1α，HIF1α）在缺氧的胃癌细胞SGC7901的表达及其同缺氧时Fas、PCNA关系，探讨HIF1α同缺氧时胃癌细胞增殖凋亡的关系。方法产气袋法(GasPaK)制造缺氧细胞培养条件，细胞免疫化学观察SGC7901细胞HIF1α、PCNA及Fas的变化。结果缺氧时SGC7901细胞HIF1α表达明显上调，HIF1α表达随缺氧时间延长而增加。缺氧时HIF1α表达与Fas呈负相关（P<0.05），同PCNA表达无关。结论缺氧能使SGC7901细胞HIF1α表达明显上调，HIF1α抑制缺氧诱导的细胞凋亡，同缺氧时胃癌细胞增殖无关。

【关键词】 缺氧诱导因子1α 胃癌细胞SGC7901 细胞凋亡；增殖

　Expression of HIF1α and Its Relationship to Apoptosis and Proliferation in Gastric Cancer Cell During Hypoxia

Key words：Hypoxiainducible factor1α; Gastric cancer cell SGC7901; Apoptosis; Proliferation

　　资料显示，实质性肿瘤发生过程中，由于血管生长的相对滞后和肿瘤细胞的快速增殖导致肿瘤细胞缺氧[13]。缺氧是实质性肿瘤微环境的基本特征之一。缺氧诱导因子（hypoxiainducible factor,HIF1）是在缺氧条件下广泛存在于人和哺乳动物体内的一种转录因子。由HIF1α 和HIF1β亚单位组成，HIF1α是HIF1特有的受缺氧调控的亚基，决定HIF1的活性。HIF1α是迄今为止发现的唯一一个特异性缺氧状态下发挥活性的转录因子。近年来，随着对HIF1α研究的进一步深入，发现它广泛存在于动物和人类的多种肿瘤细胞中，其活性对维持肿瘤细胞能量代谢、新生血管形成、促进肿瘤侵袭和转移起重要作用。探讨HIF1α同缺氧条件下肿瘤细胞凋亡、增殖的关系，了解其在肿瘤细胞凋亡、增殖的作用。对于研究HIF1α在肿瘤发生、发展中的作用及探索以HIF1α为靶点的抗肿瘤治疗有重要意义。本研究通过对人胃癌细胞SGC7901中HIF1α的表达及其同缺氧时Fas、PCNA表达的检测，探讨HIF1α在胃癌发生、发展中可能的作用。

1 材料及方法

1.1 材料

人胃癌细胞株SGC7901，重庆医科大学病理生理教研室提供。兔抗人Fas多克隆抗体（工作浓度1∶200），SP免疫组化试剂盒，购于北京中山生物技术有限公司。鼠抗人PCNA多抗（工作浓度1∶400）购于武汉博士德生物工程公司。鼠抗HIF1α单抗（工作浓度1∶25），购于晶美生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 微缺氧条件的制造

运用产气袋法(GasPaK)制造微缺氧条件。通过血气分析仪监测含小牛血清的RPMI1640培养液中PO2、PCO2和pH的变化，本装置在48h内PO2、PCO2和pH稳定，并能达到微缺氧细胞培养的条件（1%～5%氧、5%CO2及90%氮）。

1.2.2 不同氧状态下细胞爬片的制备

取对数生长期的SGC7901细胞，用含10%小牛血清RPMI1640培养液，配成浓度为5×104 /ml的细胞悬液。并分为对照组、缺氧4h组、缺氧8h组、缺氧16h组。各取细胞悬液2ml/孔分别接种于装有盖玻片的6孔培养板内。对照组入CO2培养箱（20%氧、5%CO2、75%氮、37℃）中培养72h，缺氧4h组、缺氧8h组、缺氧16h组。分别入CO2培养箱培养68、64、56h后，再入微缺氧装置内继续培养4、8、16h。

1.2.3 SP免疫组化法检测HIF1α、Fas、PCNA

取出6孔板内已爬满细胞的盖玻片，PBS洗涤，4%多聚甲醛固定, 0.3%H2O2/甲醇作用30min, 正常羊血清阻断30min, 分别给缺氧组和对照组依次加入稀释的一抗HIF1α、Fas、PCNA，4℃孵育过夜,生物素化二抗和辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素依次处理(37℃,孵育30min), 期间均用PBS洗涤, AEC显色, 水溶性封片剂封片。每次染色时均以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.2.4 判断标准

排除爬片边沿细胞，10×10低倍镜下随机选取10个细胞分布均匀的视野，10×20中倍镜下随机计数50个细胞／每视野。按着色强弱分4个等级，按公式HSCORE＝∑Ｐi(i+1)(i=0、1、2、3;Pi表示评分为i的比例) 计算HSCORE得分。

1.3 统计学处理

所有数据均用±s表示，采用F检验及q检验分析，数据均用统计软件包SAS8.0分析。用Spearman等级相关分析HIF1α同SGC7901细胞PCNA、Fas的相互关系。

2 结果

2.1 不同氧状态下人胃癌细胞株SGC7901 HIF1α、Fas 、PCNA的表达

常规培养条件下SGC7901细胞仅个别细胞有HIF1α阳性表达，低氧处理4h后HIF1α出现阳性表达，并随低氧处理时间的延长逐渐增加（rs=0.935），见图1。常规培养条件下Fas、PCNA均在SGC7901细胞有阳性表达，低氧处理4h后Fas表达增加，但随低氧处理时间的延长，Fas表达所有下降（rs=-0.972），见图2、3。PCNA在不同氧状态下的表达无明显差异，见表1。表1 不同氧状态下HIF1α、Fas 和PCNA在SGC7901细胞的表达常规培养条件下由于HIF1α在SGC7901细胞低表达，无法判断其同Fas及PCNA的关系。缺氧条件下SGC7901细胞HIF1α表达同Fas表达呈负相关（rs=-0.961,P<0.05），同PCNA表达无关（rs=-0.632,P>0.05）。

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