维生素E琥珀酸酯下调mdr1/Pgp表达逆转K562/ADM耐药细胞的凋亡抑制(1)-找论文网

作者：郭璐，魏虎来，张亚莉，刘建民

【摘要】 　　目的研究维生素E琥珀酸酯（Vitamin E succinate, VES）诱导多药耐药K562/ADM细胞凋亡的分子机制。方法采用四氮唑蓝比色法（MTT）检测K562/ADM增殖活性；细胞形态学和Annexin V/PI双标记法检测细胞凋亡；RTPCR检测mdr1基因和Caspase3基因mRNA的表达；流式细胞法（FCM）测定Pgp蛋白表达水平和Caspase3活性。结果 VES显著抑制K562/ADM细胞的增殖；经VES处理后细胞形态上出现典型的凋亡改变；Annexin Ⅴ/PI双染检测凋亡细胞明显增加；mdr1 mRNA表达和P糖蛋白（Pglycoprotein，Pgp）合成明显降低，Caspase3 mRNA表达和Caspase3活性显著增强；VES增加K562/ADM细胞对ADM的敏感性。结论 VES诱导mdr1/Pgp高表达的K562/ADM耐药细胞凋亡，其主要机制为下调mdr1/Pgp表达而逆转Pgp介导的细胞凋亡抑制和耐药性。

【关键词】 维生素E琥珀酸酯　多药耐药　凋亡抑制　P糖蛋白；Caspase3；白血病

Key words：Vitamin E succinate; Multidrug resistance; Apoptosis resistance; Pglycoprotein; Caspase3; Leukemia

　　维生素E琥珀酸酯（Vitamin E succinate, VES）是α生育酚的6位羟基与琥珀酸酯化而形成的衍生物。研究证实，VES可选择性地杀伤人白血病、乳腺癌、前列腺癌等多种肿瘤细胞，而对正常细胞无抑制效应[13]。有关VES对耐药白血病（肿瘤）细胞作用的研究少见，我们曾研究证实VES可抑制白血病K562/ADM耐药细胞增殖并诱导其凋亡[4]。本文以白血病多药耐药K562/ADM细胞为模型，观察VES诱导其凋亡过程中耐药基因mdr1及其编码产物P糖蛋白（Pglycoprotein，Pgp）表达的变化，探讨VES诱导耐药细胞凋亡的分子机制。

1 材料和方法

1.1 试剂

维生素E琥珀酸酯（Vitamin E succinate, VES）为美国Sigma公司产品，用无水乙醇配制成50 mmol/L的储存液。RPMI1640为美国Gibco BRL公司产品；新生牛血清购自杭州四季清生物工程材料研究所。阿霉素（ADM）为日本明治制药公司产品。MTT、SDS、琼脂糖、RNase、溴化丙锭（EB）、碘化丙啶（PI）和二乙基焦碳酸（DEPC）均由美国Sigma公司出品。100bp DNA Ladder Marker由美国Promega公司出品。抗Pgp单抗（MRK16）为Kamiya Biomedical公司产品，PE标记的羊抗鼠IgG2a为Caltag公司产品。TRIZOL试剂由美国Invitrogen公司生产。AMV一步法RTPCR试剂盒购自上海生物工程有限公司。mdrl、Caspase3和βactin基因引物由上海生物工程有限公司合成。FITC标记的DEVDFMK和Annexin V试剂盒为Biovision公司产品。

1.2 细胞培养

K562/ADM多药耐药白血病细胞由兰州大学医学实验中心保存，细胞在含有15%小牛血清、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素和2mmol/L L谷氨酰胺的RPMI1640完全培养基中，置37℃、5%CO2孵箱中培养，定期添加ADM（～5.0mg/L）以刺激mdr1/Pgp高表达。细胞在无ADM的条件下培养1周后用于实验。

1.3 细胞增殖活性

K562/ADM细胞以2×108/L接种于96孔培养板（Costar）中，分别加入10～60μmol/L VES，对照组加入终浓度<0.2%（V/V）的无水乙醇。培养24～96h后MTT比色法[5]检测，并计算细胞增殖抑制率和半数抑制浓度（IC50）。

1.4 细胞形态学观察

VES处理后的K562/ADM细胞，细胞离心涂片机（StatSpin Cytofuge 2型）离心涂片，WrighGiemsa染色，光镜观察。同时收集细胞，3%戊二醛固定，经脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，铀铅双重染色，透射电镜（JEM1230）观察细胞超微结构。

1.5 Annexin Ⅴ/PI双标记检测凋亡细胞

按试剂盒说明操作。收集K562/ADM细胞，PBS洗涤，重悬于Binding Buffer中，加入PI和FITC 标记的Annexin Ⅴ，室温避光染色5min，流式细胞仪（BeckmanCoulter Epics XL）检测[6]。

1.6 RTPCR检测mdr1和Caspase3基因mRNA表达

TRIZOL法提取细胞总RNA，以βactin为内参照，AMV一步法RTPCR检测 mdr1和Caspase3 基因mRNA表达情况。引物分别为：mdr1：上游5’CCCATCATTGCAATAGCAGG3’，下游5’GTTCAAACTTCTGCTCCTGA3’，扩增产物167bp；Caspase3:上游5’CAAACTTTTTCAGAGGGGATCG3’，下游5’GCATACTGTTTCAGCATGGCAC3’，扩增产物272 bp；βactin：上游5’GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3’，下游5’CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC3’，扩增产物548bp。PCR扩增产物凝胶电泳，凝胶图像分析系统（Syngene ChemiGenius 2）分析。

1.7 Pgp表达测定

收集K562/ADM细胞，PBS洗涤，分别加入鼠抗人Pgp单抗MRK16（一抗）和PE标记的羊抗鼠IgG2a（二抗），FCM检测Pgp的表达阳性率和平均荧光强度（MFI）[7]。

1.8 Caspase3活性测定

根据试剂盒说明操作。收集细胞，PBS洗涤，加入FITCDEVDFMK，37℃孵育1h，洗涤，FCM检测活化Caspase3活性[8]。

1.9 药物敏感性

K562/ADM细胞经20μmol/L和40μmol/L VES与不同浓度的ADM联合处理48h，细胞终止培养后MTT比色法[5]检测并计算细胞增殖抑制率。

1.10 统计学分析

采用SPSS10.0统计软件进行相关性分析和直线回归。

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