PTEN在胃癌细胞中的表达及其CpG岛甲基化状态的研究(1)-找论文网

作者：刘芬，于皆平，邓全军，齐元玲，于红刚

【摘要】 　　目的检测抑癌基因PTEN在四种胃癌细胞中mRNA和蛋白表达水平及其 5’启动子区CpG岛甲基化状态。方法采用甲基化特异性聚合酶链反应（Methylationspecific PCR,MSP）检测四种不同分化程度的胃癌细胞（HGC27,MGC803,BGC823,SGC7901）中PTEN基因启动子区域甲基化状态，RTPCR和Western blot法分别检测其mRNA和蛋白表达水平。结果除SGC7901外，其他三种细胞可检测到PTEN基因启动子的甲基化。PTEN mRNA和蛋白表达水平依次为：SGC7901最高(P<0.01)，BGC823、MGC803次之(两者间无显著性差异,P>0.05)，HGC27表达水平最低(P<0.01)，其表达与细胞分化程度呈正相关趋势。结论 PTEN基因启动子区异常甲基化可能导致该基因转录表达失活，使其蛋白表达减少甚至缺失，这可能是导致胃癌发生、发展的原因之一。

【关键词】 胃癌　PTEN基因　甲基化

　　Studying the Expression of PTEN and Its CpG Island Methylation Status in Gastric Carcinoma Cells

Department of Gastroenterology，Renmin Hospital of Wuhan University，Wuhan 430060，ChinaAbstract：Objective To detect hypermethylation status of the 5’ CpG island locating in the promoter region of PTEN gene and the expression level of their mRNA and protein in 4 gastric carcinoma cells. Methods Using methylationspecific PCR(MSP) technique to detect methylation status of PTEN gene in 4 different differentiation gastric cancer cells(HGC27,MGC803,BGC823,SGC7901),RTPCR and Western blot technique to detect their mRNA and protein expression level. Results Except SGC7901,other three cells were detected hypermethylation of PTEN gene. The mRNA and protein expression were highest in SGC7901(P<0.01),higher in BGC823、MGC803(P<0.01) and lowest in HGC27(P<0.01). The level of PTEN mRNA, protein expression and their differentiation were correlated. Conclusion Hypermethylation can inactivate the transcription of PTEN and reduce its protein expression. It may be a considerable mechanism which leads to oncogenesis, metastasis of gastric carcinoma.

Key words：Gastric carcinoma; PTEN gene; Methylation

　胃癌的发生涉及癌基因功能增强，抑癌基因突变或功能缺失。作为第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因PTEN（Phosphates and Tension homolog deleted on chromosome Ten），在多种肿瘤中存在失活现象，其失活的原因除突变、缺失外，5’CpG岛异常甲基化可能是其失活的第三条途径。本研究采用敏感的甲基化特异性PCR（MSP）方法检测PTEN基因启动子在四种不同分化程度的胃癌细胞中的甲基化状态，并通过RTPCR和Western blot法检测该四种细胞中PTEN mRNA水平和蛋白表达，探讨PTEN甲基化改变、表达异常与胃癌的关系，为胃癌的发生机制提供分子生物学依据，以期为胃癌的治疗探索新途径。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系胃癌细胞HGC27(未分化),MGC803,BGC823(低分化),SGC7901(中分化)购自上海生命科学研究院。

1.1.2 主要试剂 Trizol试剂盒，RPMI1640培养基(Gibco公司)；胎牛血清(Hyclone公司)；亚硫酸氢钠，氢醌，鼠抗人βactin抗体，硝酸纤维素膜(Sigma公司)；Wizard DNA clean up system(Promega公司)；Sss1酶(New England Biolabs公司)；小鼠抗人PTEN抗体，ECL试剂盒(Santa Cruz公司)；PTEN甲基化和未甲基化引物及PTEN和β表1 用于MSP、RTPCR各引物序列、产物大小和退火温度注：MSP两对引物中经亚硫酸氢钠处理后改变的碱基用黑体字标出，甲基化和非甲基化引物序列中碱基的不同用下划线标出ctin引物由上海生工合成。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 4种细胞用含10%胎牛血清(56℃灭活30min)，100u/ml青霉素和100u/ml链霉素的RPMI1640培养液(pH7.2)，在37℃、5 %的CO2培养箱中培养。

1.2.2 RTPCR检测PTEN mRNA水平 Trizol一步法提取细胞总RNA，经逆转录后再以cDNA为摸板扩增。PTEN基因和βactin的引物序列，见表1。PTEN PCR反应条件：94℃ 3min，以94℃30s，54℃30s，72℃45s循环20次，72℃延伸7min；βactin PCR反应条件：94℃ 3min，以94℃40s，56℃45s，72 ℃60s循环20次，72 ℃延伸7min。1.5％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统拍照并检测吸光度值，将PTEN与βactin吸光度比值作为其mRNA水平的相对值。重复实验6次，取均值。

1.2.3 Western Blot法检测PTEN基因蛋白表达水平提取细胞总蛋白，Bradford法测蛋白浓度。10％PAGE凝胶电泳，电转，加入一抗二抗，显色。暗室内X光底片感光成像并进行图像分析，计算条带的积分吸光度(IA)，将PTEN与βactin吸光度值的比值作为其蛋白表达的相对值。上述步骤重复6次，取均值。

1.2.4 DNA的提取、修饰和纯化用经典的蛋白酶K苯酚氯仿法抽提细胞DNA，参照Herman的方法[1]，依次采用氢醌及亚硫酸氢钠，Wizard DNA clean up试剂盒修饰，纯化DNA。完全甲基化对照是将正常人外周血淋巴细胞DNA与SAM(终浓度160μM),1×NEBuffer2和1U的Sss1酶共同37℃孵育2h后再经亚硫酸氢钠修饰；完全未甲基化对照仅用亚硫酸氢钠处理；阴性对照分别用没有经亚硫酸氢钠处理的DNA和H2O代替模板DNA进行PCR。

共2页: 1 [2] 下一页

维生素E琥珀酸酯下调mdr1/Pgp表达逆转K562/ADM耐药细胞

髓母细胞瘤X线与质子适形放射治疗计划比较