PTEN在胃癌细胞中的表达及其CpG岛甲基化状态的研究(2)-找论文网

1.2.5 MSP 引物设计根据PTEN基因序列(GenBank accession number AF143312),MethPrimer软件，并参照Salvesen HB,Kang GH,Kang YH等[24]合成，见表1。25μl PCR反应总体系为：10×Taq酶Buffer 2.5μl，dNTP 2.0μl(终浓度200μM)，Taq酶0.5μl(1u)，上下游引物各25pmol，MgCL 1.0μl，模板DNA 2～3μl，补足水至25μl。反应条件为：94℃热启动11min后开始35个循环：94℃40s，63℃45s，72℃1min，最后于72℃延伸12min，4℃保存。产物经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳溴化乙锭染色后在紫外光下观察，凝胶成像系统拍照。

1.3 统计学分析

所有数据用±s表示，用SPSS11.5软件进行统计学分析，P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 PTEN mRNA和蛋白表达水平见表2。

mRNA和蛋白水平SGC7901细胞显著高于HGC27细胞(t=18.1536,P<0.01)及MGC803和BGC823细胞(t=9.010,P<0.01；t=7.4567,P<0.01)，后两者显著高于HGC27细胞(t=9.14,P<0.01；t=10.697,P<0.01)，但是MGC803和BGC823细胞之间蛋白表达水平无明显差异(t=1.5535,P>0.05)。如图1、2所示。可见随着胃癌细胞分化程度的降低，PTEN mRNA和蛋白表达逐渐减少，两者呈正相关趋势。表2 四种胃癌细胞中PTEN mRNA和蛋白表达水平

2.2 PTEN基因启动子区CpG岛的甲基化状态

HGC27(未分化)、MGC803、BGC823(低分化)细胞，两种引物均有目的片段的扩增，提示了这三种细胞PTEN基因CpG岛发生了部分程度甲基化，SGC7901(中分化)只有PTENU有目的片段的扩增，提示其没有发生甲基化。完全甲基化阳性对照只扩增出206bp的条带，完全未甲基化阳性对照只扩增出162bp的条带，阴性对照均无目的条带扩增，见图3。

3 讨论

自从抑癌基因PTEN被发现，至今已发现包括胃癌在内的多种肿瘤中都存在着PTEN改变，如子宫内膜癌、卵巢癌、宫颈癌、乳腺癌、恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌[58]。肿瘤细胞中导致PTEN基因沉默的原因之一是缺失和突变；导致PTEN沉默的另一原因即是其5’启动子区的CpG岛甲基化。PTEN基因的CpG岛甲基化将导致转录抑制，进而导致其表达产物PTEN蛋白的减少甚至缺失。

本实验研究了四种胃癌细胞甲基化状态及其mRNA水平和蛋白的表达。HGC27(未分化)、MGC803、BGC823(低分化)细胞PTEN基因启动子区CpG岛可检测到甲基化，SGC7901(中分化)细胞则未检测到甲基化，且细胞分化程度越低，PTEN mRNA与蛋白表达水平越低。这一结果与Kang等［3］、Kang等［4］的报道一起说明PTEN在人胃癌细胞和组织中均发生了一定程度的甲基化，这可能是引起PTEN mRNA表达减少并导致其蛋白表达减少或缺失的机制之一，但是，Sato等[9]研究却认为PTEN并未发生甲基化。这可能是由于PTEN基因启动子区富含的CpG岛并未全部发生甲基化，在进行PCR扩增中所设计的引物并未能针对已发生甲基化的区域扩增。另外，不同细胞株(即使是同一细胞株的不同细胞)来的DNA甲基化程度可能不一样，这都是导致结论不一的原因。另外我们发现，PTEN mRNA和蛋白表达水平与细胞分化程度呈正相关趋势。一般来说，细胞分化程度越低，其恶性程度就越高，病人预后越差。

此实验通过对PTEN基因表达和甲基化状态的研究，为胃癌的发生机制提供了分子生物学依据，也为肿瘤的治疗提供了新的思路。但该结果仅从DNA、RNA和蛋白水平分析PTEN在胃癌发生发展中的异常改变，其参与肿瘤发生发展的机制还有待于进一步研究。

【参考文献】
　　［1］ Herman JG, Graff JR, Myohanen S, et al. Methylationspecific PCR: A novel PCR assay for methylation status of CpG islands[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1996,93 (18): 98219826.

[2] Salvesen HB, Stefansson I, Kretzschmar EI, et al. Significance of PTEN alterations in endometrial carcinoma: a populationbased study of mutations, promoter methylation and PTEN protein expression[J]. International Journal of Oncology, 2004,25 (6):16151623.

[3] Kang GH, Lee S, Kim WH, et al. EpsteinBarr VirusPositive Gastric Carcinoma Demonstrates Frequent Aberrant Methylation of Multiple Genes and Constitutes CpG Island Methylator PhenotypePositive Gastric Carcinoma[J]. American Journal of Pathology, 2002, 160 (3):787794.

[4] Kang YH, Lee HS, Kim WH, et al. Promoter methylation and silencing of PTEN in gastric carcinoma[J]. Laboratory Investigation, 2002,82 (3):285291.

[5] Schondorf T, Ebert MP, Hoffmann J, et al. Hypermethylation of the PTEN gene in ovarian cancer cell lines[J]. Cancer Letters,2004, 207 (2): 215220.

[6] Cheung TH, Lo KW, Yim SF, et al. Epigenetic and genetic alternation of PTEN in cervical neoplasm[J]. Gynecologic Oncology,2004, 93 (3): 621627.

[7] Khan S, Kumagai T, Vora J, et al. PTEN promoter is methylated in a proportion of invasive breast cancers[J]. International Journal of Cancer,2004, 112 (3): 407410.

[8] Furuta J, Umebayashi Y, Miyamoto K, et al. Promoter methylation profiling of 30 genes in human malignant melanoma[J]. Cancer Science,2004, 95 (12): 962968.

[9] Sato K, Tamura G, Tsuchiya T, et al. Analysis of genetic and epigenetic alterations of the PTEN gene in gastric cancer[J]. Virchows Archiv,2002,440 (2): 160165.

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