顺铂诱导卵巢癌耐药细胞系A2780/DDP凋亡的时间和剂量依从性(1)-找论文网

作者：符淳,李光仪, 刘晓英 ,林秋华, 刘风英, 谢咏

【摘要】 目的探讨不同浓度顺铂作用不同时间诱导敏感和耐药卵巢癌细胞系发生凋亡变化规律和凋亡途径相关蛋白的表达。方法选择卵巢癌顺铂耐药细胞系 A2780/DDP和敏感细胞系A2780为研究对象。在细胞培养基础上，运用MTT比色法、原位标记法、常规免疫组化和蛋白印迹等方法，观察不同剂量的顺铂（5、10、20、40μmol/L）和作用不同时间（24、48、72h）对A2780和A2780/DDP细胞凋亡的影响和此动态变化过程中半胱天冬氨酸蛋白酶2（Caspase2）和3（Caspase3）表达。结果顺铂对A2780和A2780/DDP细胞系凋亡的诱导呈时间和剂量依从性。细胞凋亡蛋白Caspase2和Caspase3的活化促进顺铂诱导的凋亡,其表达呈现出对顺铂作用时间和剂量的依从性。结论（1）在顺铂耐药机理中，药物在体内分布和代谢，对血药有效浓度的影响和细胞对药物排斥引起顺铂进入细胞存在一定的阻碍可能是降低顺铂敏感性的因素。（2）Caspase2和caspase3蛋白活化延后和活性降低可能是影响耐药A2780/DDP细胞凋亡的原因。

【关键词】 顺铂耐药;凋亡;Caspase2;Caspase3;人卵巢癌

CisplatinInduced Apoptosis in Cisplatinresistant Ovarian Cancer Cell Line A2780/DDP on Time and Dose Dependence

Key words：Cisplatinresistance;Apoptosis;Caspase2;Caspase3;Human ovarian caner

卵巢癌细胞顺铂耐药是降低患者5年生存率的关键问题。耐药的卵巢癌细胞表现为自发凋亡能力明显下降和癌细胞无限制恶性增殖生长 [1]。顺铂诱导卵巢癌细胞凋亡过程中最显著的变化是细胞内经线粒体凋亡途径激活[2]。从时间和剂量角度把握顺铂诱导卵巢癌细胞A2780和耐药细胞A2780/DDP发生凋亡的变化规律，了解在凋亡上游途径起传导信号作用的Caspase2蛋白和下游起执行作用的Caspase3蛋白表达变化方式，将有助于进一步理解卵巢癌顺铂耐药机制。

1材料与方法

1.1人卵巢癌细胞系

A2780和A2780/DDP均购自同济医院肿瘤中心，A2780/DDP细胞系对顺铂的耐药是A2780细胞系的9.4倍[3]。用含有10%胎牛血清的DMEM完全培养基，在37℃、5%CO2、相对湿度90%的培养箱中培养。

1.2主要试剂

顺铂（批号H37021358）：山东齐鲁制药厂产品，分子量为300.3。考马斯亮兰蛋白质测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。Caspase2（BA0587，200μg/ml）、Caspase3（BA0588，200μg/ml）和actin（200μg/ml）兔多克隆抗体、细胞凋亡检测试剂盒（MK1020），即用型SABC免疫组化染色试剂盒（SA1022）、蛋白质印迹（Western blotting）检测试剂盒（SA2022）、DAB显色试剂盒均购自武汉博士德公司。

1.3主要方法

1.3.1顺铂对卵巢癌细胞A2780和A2780/DDP生长抑制效果 MTT法测定，顺铂终浓度分别为0、2、5、10、20、40、80、200μmol/L（μM），分别培养24、48、72h；计算不同浓度顺铂对细胞生长抑制率：抑制率=（对照组A均值－实验组A均值）/对照组A均值。

1.3.2顺铂对卵巢癌细胞系A2780和A2780/DDP凋亡诱导根据1.3.1结果，选择5种顺铂浓度（0、5、10、20、40μmol/L）分别诱导细胞凋亡24、48、72h后终止实验作成细胞爬片或收集细胞，实验1.3.3～1.3.5均按此方法进行。

1.3.3末端脱氧核糖核酸转移酶（TDT）原位标记法检测细胞凋亡和判断标准根据试剂盒步骤检测。阳性及半定量判断标准：细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性凋亡细胞。阳性半定量方法为：每例（400×镜下）选取9个视野，即玻片左、中、右3区各取前、中、后3个视野，计算各视野内卵巢癌细胞数和阳性细胞数，计算其阳性细胞的百分比例。

1.3.4Caspase2蛋白在顺铂诱导卵巢癌细胞A2780和A2780/DDP凋亡中表达提取卵巢癌细胞蛋白质；测定蛋白质浓度；蛋白质的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳；将蛋白样本转膜；按试剂盒所示行蛋白质印迹法检测。其中一抗效价为1∶400～1∶500，选对照为actin（50μg）。

1.3.5顺铂诱导卵巢癌细胞A2780和A2780/DDP凋亡中Caspase3蛋白检测和判断标准：按免疫组化SABC方法进行，加入一抗效价为1∶100。阳性判断标准：细胞核或胞浆呈棕黄色至深棕色者为阳性细胞。阳性半定量方法同1.3.3所示。

1.4统计学方法

采用SPSS11.0统计软件包，对计量资料进行方差齐性检验。方差齐性者，用单因素方差分析(oneway ANOVA)检验总体均数差异性，有显著性差异者再进行两两比较(StudentNewmanKeuls Test)。P＜0.05为差异有显著性。

2结果

2.1顺铂对卵巢癌细胞A2780和A2780/DDP生长抑制

顺铂对A2780细胞系生长抑制呈明显剂量时间依赖关系：顺铂作用48h后，明显抑制A2780细胞生长，其中20μmol/L为顺铂作用48h半数抑制剂量。顺铂对A2780/DDP细胞生长抑制也呈剂量时间依赖关系，特点是：效应强度明显弱于A2780细胞，尤以低于40μmol/L浓度效应弱于A2780中相应剂量；效应时间明显滞后， 72h才出现稍明显生长抑制。故本研究选定4个不同浓度（5、10、20、40μmol/L）顺铂在以下实验中作为刺激浓度来诱导A2780和A2780/DDP凋亡。

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