2.2TDT原位标记法检测卵巢癌细胞凋亡
顺铂培养A2780和A2780/DDP细胞72h内，发生凋亡细胞率呈时间剂量依赖，这种趋势在A2780细胞中明显。(10～40)μmol/L顺铂作用A2780细胞48h和(5～40)μmol/L的顺铂作用A2780细胞72h，凋亡数均明显多于其相同剂量作用24h者。对A2780/DDP细胞而言，只有当20μmol/L和40μmol/L顺铂作用72h时，细胞凋亡数才明显多于其相同剂量作用24h者，见表1。表1顺铂作用A2780和A2780/DDP凋亡阳性细胞计数结果A2780细胞P＜0.05：各时间组间；24h组中从20μM顺铂组起， 48h组和72h组中从10μM顺铂组起，阳性细胞率明显增多。A2780/DDP细胞P＜0.05：72h组中20μM和40μM顺铂组较24h和48h两组中相同剂量诱导者明显增多
2.3Western blot检测Caspase2蛋白表达
Caspase2基因编码的两个蛋白Caspase2L和Caspase2S在两个卵巢癌细胞系中均有不同程度表达， Western blot中检测的Caspase2蛋白表达变化实际上是指48Kda的Caspase2L蛋白的改变，其35Kda的Caspase2S蛋白变化不明显（无特殊说明，以下Caspase2指Caspase2L）。A2780细胞中Caspase2蛋白在顺铂作用24h和48h时，从10μM顺铂开始其表达增高；随着顺铂作用时间延长，到72h时，从5μM顺铂即开始表现增高。A2780/DDP中Caspase2蛋白表达在顺铂作用24h和48h的各剂量组间表达无明显变化；等到顺铂作用72h后，从10μM顺铂起，Caspase2表达开始增高,见图1、2。
2.4Caspase3蛋白在顺铂诱导卵巢癌细胞A2780和A2780/DDP凋亡中表达
Caspase3蛋白病理表现形式主要为胞浆和胞核同时着色，尤以胞核着色明显。其在A2780细胞表达随顺铂作用时间延长和剂量增加有明显增多趋势，这种趋势尤其显著体现为：24h组中从20 μM顺铂组起，48h组和72h组中从10μM顺铂组起，阳性细胞率明显增高。Caspase3蛋白在A2780/DDP细胞中表达，5μM和10μM顺铂作用下随时间改变不明显，当顺铂剂量为20μM和40μM时，作用72h后Caspase3蛋白表达有明显提高，但这种效应仍明显低于A2780细胞中，见表2。
3讨论
3.1顺铂诱导卵巢癌细胞A2780和A2780/DDP凋亡的时间和剂量依从性
肿瘤细胞对化疗耐药的机制是多方面的[4]。研究发现卵巢癌细胞系A2780和顺铂耐药系A2780/DDP对顺铂敏感性呈时间和剂量依从关系。随着顺铂作用时间延长和剂量增加，对两细胞系生长均呈明显抑制，出现时效和量效相关性。说明在顺铂耐药机制中，药物在体内分布和代谢，对血药有效浓度的影响可能是顺铂敏感性降低的因素之一。随着剂量增加，细胞内外药物浓度梯度增加，进入细胞内趋向性增强。这一现象表明卵巢癌细胞对顺铂敏感性差可能与顺铂进入细胞存在一定的阻碍。
比较研究A2780和A2780/DDP两个细胞系发现，A2780/DDP需要更高浓度和更长作用时间，才能得到与A2780相同的效果，耐药细胞对药物的进入可能有排斥效果。在临床上考虑药物代谢和分布的影响，若提高到与体外实验相同敏感的剂量，人体是难以耐受其副作用的。这一现象提示在临床上可用靶向治疗方法以提高局部药物浓度达到治疗作用。在除外剂量这一因素后，随着作用时间延长，A2780/DDP耐药系出现对顺铂敏感，尽管A2780/DDP对顺铂耐药，随着作用时间延长，这种耐药会被消弱。
3.2细胞凋亡蛋白Caspase2和Caspase3在顺铂诱导卵巢癌细胞A2780和耐药细胞A2780/DDP凋亡中的表达呈时间和剂量依从性
本研究发现Caspase2L和Caspase2S蛋白在两个卵巢癌细胞系中均有表达，其中Caspase2L蛋白无论从表达量还是变化形式来说，都是A2780和A2780/DDP两个细胞系中最主要的表达形式，因此Caspase2对这两种细胞凋亡均起正性效应[5]。在顺铂诱导卵巢癌细胞凋亡的动态变化过程中观察Caspase2蛋白变化情况，则能较好地反映Caspase2的活性。随着顺铂作用时间延长和剂量增加，Caspase2蛋白的表达呈时间和剂量依从性，这种趋势在A2780中尤为显著。进一步研究显示这种时间和剂量的依从性与相同条件下顺铂诱导A2780和A2780/DDP细胞凋亡的时间和剂量依从性的变化相吻合。Caspase2蛋白在顺铂敏感系A2780和耐药系A2780/DDP中发挥效应时间和程度不等，它仍可能是这两个细胞系中在顺铂诱导凋亡中起重要作用的Caspase。耐药卵巢癌细胞Caspase2蛋白活化延后和程度降低，其上游激活途径可能受到了明显抑制。Caspase3是一种重要的凋亡效应蛋白，它可对Caspase2参与的线粒体调节和随后线粒体发生的变化起反应，执行凋亡命令[6]。Caspase3蛋白在顺铂诱导A2780和A2780/DDP细胞系凋亡中的表达方式与Caspase2蛋白类似，即Caspase3蛋白表达呈时间和剂量依从性，在顺铂敏感细胞系突出，且时间和剂量依从性与相同条件下顺铂诱导凋亡的时间和剂量依从性变化一致。有所区别的是Caspase3在耐药系A2780/DDP的活性明显弱于Caspase2蛋白。Caspase3蛋白在卵巢癌细胞系A2780和A2780/DDP中病理表现形态多样化，如胞浆型、胞核型和胞浆胞核型，以胞浆胞核型最常见。从侧面可能反映了Caspase3蛋白在顺铂诱导凋亡中功能活跃。Caspase2和Caspase3蛋白在顺铂诱导其敏感细胞系A2780和耐药系A2780/DDP凋亡中表达均呈时间和剂量依从性，共同表达方式提示这两种蛋白表达变化可能与其编码基因突变导致的蛋白活性丧失或降低关系不大，而与一些外界因素，如进入细胞内的有效药物浓度密切相关，当接触到足量药物和作用时间延长，这两种蛋白在顺铂耐药的细胞中均能被活化，发挥作用。
综上所述，在顺铂耐药机制中，药物在体内分布和代谢，对血药有效浓度的影响和细胞对药物排斥引起顺铂进入细胞存在一定的阻碍可能是降低顺铂敏感性的因素。Caspase2和Caspase3蛋白活化延后和活性降低可能是影响耐药的A2780/DDP细胞凋亡的原因。在初次治疗卵巢癌或对已耐药的卵巢癌的治疗中，应尽可能用提高局部药物浓度或中小剂量持续应用的方法，可能会产生一些积极的效果。
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