【摘要】 目的 通过构建血清诊断模型，探讨血清蛋白质谱在诊断单纯性室间隔缺损中的意义。方法 采用病例对照研究设计，用CM10蛋白质芯片检测56例单纯性室间隔缺损患儿、85例儿科常见病患儿及23例其他先天性心脏病患儿血清，筛选血清差异蛋白，并构建诊断模型。结果 完整模型ROC曲线下面积、预测准确率、灵敏度、特异度、阳性预测值及阴性预测值分别为0.988、95.00％、100.00％、92.42％、87.18％和100.00％，简化模型ROC曲线下面积、预测准确率、灵敏度、特异度、阳性预测值及阴性预测值分别为0.948、94.00％、88.24％、96.97％、93.75％和94.12％。简化模型与完整模型之间预测准确率、灵敏度及特异度比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 利用血清蛋白质谱建立的诊断模型能够较好地区分病例与对照，对诊断室间隔缺损具有一定的发展和应用前景。
【关键词】 血清蛋白质谱； 室间隔缺损； 病例对照研究
【Abstract】 Objective To explore the value of serum protein profiling for diagnosis of isolated ventricular septal defect (VSD) through developing the serum diagnostic model. Methods Using casecontrol design, serum samples from 56 isolated VSD patients, 85 patients with common pediatric diseases and 23 patients with other congenital heart disease were detected by CM10 ProteinChip for searching the proteins that were significantly different between serum of VSD and control. Diagnostic model was established by Biomarker Patterns software. Results In the intact model and the terse model, the area under receiver operating characteristic curve, accuracy, sensitivity, specificity, positive predictive value and negative predictive value were 0.988 and 0.948, 95.00%(95/100) and 94.00%(94/100), 100.00%(34/34) and 88.24%(30/34), 92.42%(61/66) and 96.97%(64/66), 87.18%(34/39) and 93.75%(30/32), and 100.00%(61/61) and 94.12%(64/68), respectively. Between these two models, the accuracy, sensitivity, and specificity were similar (P>0.05). Conclusions The model, constructed by serum protein profiling, has capability of distinguishing the cases from the controls, and shows great potential for diagnosis of VSD.
【Key words】 Serum protein profiling; Ventricular septal defect; Casecontrol study
单纯性室间隔缺损(ventricular septal defect，VSD)是先天性心脏病(congenital heart disease,CHD)的常见类型，传统的影像学诊断方法不便于在人群中快速筛检出VSD患儿及对其早期干预。本研究采用病例对照研究设计，利用表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱(surfaceenhanced laser desorption/ionization timeofflight mass spectrometry,SELDITOFMS)技术获取VSD患儿与非VSD其他患儿的血清蛋白质谱，并以此构建VSD的血清诊断模型，探讨血清蛋白质谱对VSD的诊断意义。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 研究对象 病例为经多普勒超声心动图确诊的单纯性VSD患儿，对照为经多普勒超声心动图排除单纯性VSD的儿科常见病(主要为肺炎、支气管肺炎、支气管炎等)患儿和其他CHD患儿。病例与对照来自广西自壮族自治区妇幼保健院、广西医科大学第一、第三、第四附属医院及南宁市第一人民医院，收集时间为2005年3月～2005年10月。病例与对照的性别、年龄及疾病诊断情况来自医院病历，基本情况见表1。
表1 研究对象的基本情况及在模型训练集与测试集中的分布（略）
Table 1 Basic information of study objects and their distribution in training data and testing data of the model
1.1.2 主要试剂与仪器 尿素、乙酸钠、三氟乙酸、乙氰、CHAPS、DTT 、TrisHCl、HEPES和SPA(sinapinic acid)均购自Sigma公司，ProteinChip Biology System(PBS Ⅱc)质谱仪及CM10蛋白质芯片购于美国Ciphergen公司。
1.2 方法
1.2.1 血样的采集与保存 空腹采集静脉血2 ml，经静置、离心后，取血清分装于0.5 ml离心管，-80 ℃保存。
1.2.2 血清样品的处理与上样 血清样品置冰上融解、离心后，取10 μl加入含20 μl U9(9 mol/L尿素、2％CHAPS、2 mmol/L DTT、50 mmol/L TrisHCl pH9.0)的离心管中，经冰浴振荡，再加入360 μl缓冲液(50 mmol/L乙酸钠pH4.0)混匀；用缓冲液恒温孵育过的芯片每孔中加入100 μl处理好的样品，孵育1 h后，再用缓冲液孵育2次，最后每孔加入1 mM、pH4.0 HEPES 200 μl，立即甩出；取出芯片，风干后各点加SPA 0.5 μl，重复1次。
1.2.3 芯片的测定 PBSⅡc型质谱仪经NP20标准芯片校正后，用Ciphergen ProteinChip 3.2软件采集数据，设置激光强度为225，检测灵敏度为8，测定范围2 000～50 000 Da，优化范围2 000～10 000 Da。计算机以每秒1 G HZ的速度从所获得的原始数据快速精确地绘制出蛋白质质谱图。其中纵坐标为峰强度(蛋白质相对含量)，横坐标为蛋白质质荷比(mass to charge ratio,m/z)。
1.2.4 统计分析
1.2.4.1 血清诊断模型的建立与验证 分层从VSD、儿科常见病及其他CHD患儿中随机抽取60％作为训练集，其余作测试集，见表1。用Biomarker Wizard 3.2软件对训练集与测试集数据进行处理，找出有统计学意义(P＜0.05)的蛋白峰，并形成Pattern文件。用Biomarker Patterns 5.0软件及训练集Pattern文件，10fold交互验证，建立包含所有有意义预测变量的完整决策树诊断模型和包含4～6个意义较大的预测变量的简化模型。用测试集数据验证模型的可靠性和准确性。
1.2.4.2 诊断指标的计算 ROC(receiver operating characteristic)曲线下面积取自诊断模型，诊断准确率、灵敏度、特异度、阳性预测值及阴性预测值按模型中的相关信息计算。
1.2.4.3 病例与对照的均衡性检验及完整模型与简化模型的比较 用SPSS 13.0软件包作病例组与对照组之间性别构成和年龄(月)分布的均衡性检验(四格表检验和成组检验)及完整模型与简化模型之间预测准确率、灵敏度及特异度的比较(四格表检验)，检验水准α(双侧)＝0.05。
2 结果
2.1 病例与对照的均衡性 56例VSD患儿与108例非VSD儿(85例儿科常见病对照儿和23例其他先天性心脏病患儿)的性别构成比较(χ2＝0.546，P＝0.460)；年龄(月)分布比较(t＝1.611，P＝0.109)，差异均无统计学意义，说明病例组与对照组的性别、年龄均衡可比。
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