【摘要】 目的 评价一种简单客观敏感的检测淋巴结中扩散的肿瘤细胞方法：realtime RTPCR。方法 从手术的30例非小细胞肺癌病人获得纵隔淋巴结100组，分别进行常规病理学检查和realtime RTPCR检测CK19 mRNA的表达。从12例手术的非癌症病人获得纵隔淋巴结18组作为正常对照，用15例肺癌病人原发肿瘤组织作为阳性对照。结果 在94(94.0%)组经组织病理学检查未发现肿瘤细胞的淋巴结中，用realtime RTPCR在26(27.7%)组检测到CK19 mRNA的表达。6组经组织病理学检查有肿瘤细胞扩散的淋巴结中全部检测到CK19 mRNA的表达。组织病理学检查22例病人为pN0期，用realtime PCR方法在这些病人中发现13(59.1%)例病人淋巴结有微小扩散的肿瘤细胞。结论 应用real time RTPCR检测CK19 mRNA的表达是一种在纵隔淋巴结发现扩散肿瘤细胞敏感而特异的方法。
【关键词】 肺癌 隐匿性微小转移 realtime RTPCR 角质蛋白19
0 引言
在经手术完全切除肿瘤的肺癌病人中，约有40%手术后两年内复发，五年的生存率仅为60%左右[1]，复发的主要原因是残留的微小转移的癌细胞不能用常规的组织病理学方法发现。
本研究使用LightCycler系统用realtime RTPCR方法检测角质蛋白19(Cytokeratin CK19) 基因在非小细胞肺癌病人局部淋巴结的表达，研究肺癌纵隔淋巴结微小转移的诊断，评价realtime RTPCR方法在检测淋巴结中扩散的肿瘤细胞的敏感性和特异性。
1 材料和方法
1.1 研究的标本
实验组：从手术的30例NSCLC病人获得纵隔淋巴结100组，分别进行常规的病理学检查和realtime RTPCR检测CK19 mRNA的表达。
对照组：①从12例手术的非癌症病人获得纵隔淋巴结18组作为正常对照； ②用15例非小细胞肺癌病人原发肿瘤组织作为阳性对照，观察CK19 mRNA的表达。
在手术中获得的淋巴结和肿瘤组织立即放入RNA稳定溶液，储存在-20℃冰箱中。
1.2 Cytokeratin 19( CK19) 基因的检测
1.2.1 RNA的提取 提取总RNA所用试剂盒为RNeasy Midi Kit,QIAGEN。
将淋巴结(重量30～250mg) 放入液氮中速冻。在预冷的容器中研磨成细粉末，转移至15ml的试管中。加入4ml提取缓冲液RLT，涡旋混匀。根据试剂盒的说明进行操作，提取总RNA。用Biophotometer仪测定RNA浓度。用无RNase水校正零点。
1.2.2 肺癌细胞A549培养与RNA提取
本研究选用NSCLC 细胞系A549。用RPMI1640加5%～10%小牛血清培养A549细胞，收集总数为5×106的细胞进行RNA提取，步骤同淋巴结的RNA提取。
1.2.3 cDNA合成 所用试剂盒为1st strand cDNA synthesis kit for RTPCR (AMV)+, Roche。在20μl的反应体系中含组织RNA 500ng，10X反应缓冲液2.0μl，随机引物p(dN)6 2.5μl，dNTPs混合液2.0μl，AMV反转录酶1.0μl，25mmol/L MgCl2 2.5μl。先将RNA变性：65℃，15min。然后加入反应混合物溶液，设定PCR仪(带热盖的自动化热循环反应仪)程序：25℃保温10min, 42℃反应1h, 95℃处理5min以变性反转录酶，然后在4℃保存1～2h或在-20℃长期保存备用。同时设阳性对照：肺癌细胞A549，阴性对照为水。
1.2.4 real time PCR 所用的引物为Cytokeratin19 (CK19), 参考基因为Cyclophilin B (CPB)，所用试剂盒为LightCyclerCK19 quantification kit, LightCyclerCPB quantification kit。LightCycler faststart DNA master SYBR green 1 kit( Search GmbH公司，Heidelberg, 德国)。
①建立反应体系，在无菌离心管中加入以下反应成分，见表1。
②real time PCR反应： 使用LightCyclerTM PCR表1 PCR反应混合物溶液
反应物体积（μl） PCR等级水12.0LC 引物2.0LC DNA Master SybrGreen I2.0模板4.0总体积20.0
仪， 设定程序： 变性： 95℃ 10min， 延伸 95℃ 10s,68℃ 10s,72℃ 16s, 40个循环。PCR结束后自动进入熔点曲线分析：95℃ 0s,58℃10s,95℃ 0s。退火：40℃ 30s。
③标准曲线：相对定量分析：将A549肺癌细胞的RNA分别配成浓度为500ng/μl, 100ng/μl, 20ng/μl, 4ng/μl, 0.8ng/μl，合成cDNA, 用引物Cytokeratin19 (CK19), Cyclophilin B (CPB)， 进行real time PCR反应，用LightCycler分析软件产生标准曲线。
④数据分析: 使用LightCycler相对定量分析软件进行数据分析。
CK19 mRNA的表达用相对率来表示：
CK19浓度(病人) /CPB浓度 (病人)CK19浓度(A549) /CPB浓度 (A549)
2 结果
2.1 病人的临床和病理特征 实验组淋巴结取自30例NSCLC病人，其中经病理常规检查证实Ⅰ期肺癌22例，Ⅱ期5例，Ⅲ期3例。鳞癌16例，腺癌9例，大细胞癌5例。
2.2 淋巴结的病理特征 阴性对照组18组淋巴结取自12例病人，手术后病理证实为非肺癌疾病。阳性对照组共15组标本取自15例病人，病理学分类：鳞癌7组，腺癌5组，大细胞癌3组。实验组淋巴结共100组，取自30例NSCLC病人，经病理学证实未发现肿瘤细胞94组，发现有肿瘤细胞转移的为6组。
2.3 阴性对照组CK19的表达 全部淋巴结都有低水平的CK19mRNA的表达（均检测到CK19基因转录水平扩增产物的荧光谱），相对率的最高值为1.79×10-1。相对率的最高值将作为界值来分析实验组的CK19 mRNA的阳性表达。
2.4 阳性对照组CK19的表达 只有1个大细胞癌标本CK19表达的相对率低于1.79×10-1 (阴性对照组CK19相对率的最高值)。CK19 mRNA表达的阳性率为93.3%。
2.5 实验组病人的淋巴结CK19的表达(表2) 100例淋巴结中CK19阳性表达率为32.0%, 其中鳞癌占35.6%，腺癌占29.7%，大细胞癌占27.8%。病理学证实发现有肿瘤细胞转移的6组淋巴结全部表达CK19。病理学检查为阴性的94组淋巴结表达CK19 mRNA的有26组，阳性率为27.7%。表2 实验组病人的淋巴结CK19的表达
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