用realtime RTPCR技术检测肺癌淋巴结的隐匿性微小转移(2)-找论文网

组织学分类CK19 阴性CK19 阳性鳞癌29(64.4%)16 (35.6%)腺癌26 (70.3%)11 (29.7%)大细胞癌13 (72.2%)5 (27.8%)阳性淋巴结06 (100.0%)阴性淋巴结68(72.3%)26(27.7%)合计68(68.0%)32(32.0%)

2.6 根据CK19的表达NSCLC病人的分子生物学分期根据CK19的表达，病人的NStage发生明显变化。22例N0期病人有13例(59.1%)上调为N1～2期，5例N1期病人中1例上调为N2期，3例N2期病人病理证实无癌细胞扩散的淋巴结CK19 mRNA的表达均为阳性。

2.7 统计学分析使用SPSS软件用χ2检验对CK19 mRNA的表达与组织学类型，肿瘤的大小和淋巴结的分期进行分析，结果显示P>0.05, 表明不同的组织学类型，肿瘤的大小和淋巴结的分期与CK19的表达无显著性差异。

3 讨论

通常微小转移是指肿瘤细胞扩散的一种形式，这样小数量扩散的肿瘤细胞用常规检测方法不能发现，需用非常敏感的方法才能检测到[2]。病人在原发肿瘤完全切除后的数月或数年肿瘤复发，说明局部扩散的肿瘤细胞在术前就已存在，或有转移的潜在能力。

很多研究应用免疫组化方法，检出的阳性率有明显差异（4%～71%）[36]，原因可能是由于抗CK抗体与淋巴结中的网状细胞有交叉反应[78]，另外形态学标准的判断有主观因素存在。

realtime PCR是一种封闭式定量PCR扩增系统，能在短时间内对DNA分子进行扩增的，并可快速准确对DNA分子直接作定量的数据读取和分析，具有高敏感性和高精确度，能同时测定很多样本，立刻提供动态的PCR资料，省去了传统的电泳照相等操作步骤，也避免操作过程的繁琐，使交叉污染减少到最低。

CK19是一种单层上皮的特异性细胞骨架结构，是上皮角质蛋白家族中分子量最低的角质蛋白，几乎所有的单层上皮都表达CK19。CK19在肺癌中有丰富的表达，CK19在腺癌中的表达为90.3%，在鳞癌的表达为86.7%～95%[9,10]，CK19在大细胞肺癌的表达较低，为30%[11]。

本研究中将A549肺癌细胞10个、100个、1000个分别加入到5×106淋巴细胞(从正常人外周血中分离)中，用realtime RTPCR反应检测CK19基因转录水平扩增产物的荧光谱,可以在5×106背景淋巴细胞中检测到10个A549肺癌细胞。在原发肺癌的组织中，CK19 mRNA表达的阳性率达到93.3%。在6组阳性淋巴结中，全部表达CK19 mRNA。因此将CK19作为肿瘤标记物采用realtime PCR方法检测肺癌肿瘤细胞具有非常高的敏感性。

CK19在正常组织中有低水平表达，本研究的正常对照组中全部淋巴结都有CK19的低水平表达。我们选用其最高值作为分界值来区分癌组织和正常组织对CK19 mRNA的表达[12]，高于这个值为CK19 mRNA表达阳性。

在实验组的100组淋巴结中，病理证实无肿瘤细胞转移的94组淋巴结有26组淋巴结检测到CK19基因的表达，总阳性率为27.7%。30例病人中有17例病人的淋巴结检测到CK19 mRNA的表达，阳性率为56.7%，其中22例N0期病人有13例检测到CK19 mRNA的表达，阳性率为59.1%。D'Cunha等[13]用realtime PCR方法对53例NSCLC的PN0期病人的232个淋巴结检测CEA的mRNA的表达以发现微小转移的肿瘤细胞，淋巴结的阳性率为25.4%(59/232)，病人阳性率为56.6% (30/53)。我们的研究结果与D'Cunha等结果相近，尽管所用的肿瘤标记物不同。

一些学者的研究表明局部微小转移与病人的预后和生存率密切相关[14,15]。Chen等[14]用免疫组化方法检测I期NSCLC病人淋巴结的微小转移的肿瘤细胞，发现有微小转移的平均生存期为1 977天，而无微小转移的为2 456天。用常规HE染色发现肿瘤细胞的病人平均生存期为927天。本研究中的标本取自2003～2004年间手术的病人，目前尚不能统计病人的生存期及肿瘤的复发情况。

综上所述，realtime PCR技术在对微小转移的肿瘤细胞检测中，可以准确检测微小残留的肿瘤细胞的基因表达，不仅避免了免疫组化分析中大量的切片工作，长时间的操作，形态学判定标准中人为因素所至的假阳性，还避免RTPCR中容易造成的污染，是一种快速敏感和高特异性的检测方法。肺癌患者纵隔淋巴结中CK19 mRNA的阳性表达，可以作为判断可能存在局部淋巴结微小转移的参考指标，为肺癌的临床正确分期提供依据，以指导进一步的治疗。

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