【摘要】 目的 探讨肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor alpha,TNFα）基因–308位和淋巴毒素（Lymphotoxinα,LTα）基因+252位基因多态性与多发性骨髓瘤（Multiple Myeloma，MM）发病、临床及预后的相关关系。方法 用聚合酶链反应（PCR）、限制性内切酶消化及电泳技术，对32名MM患者和72名正常对照者的TNFα和LTα基因的单碱基突变多态性进行检测，并收集病人组的临床资料，进行生存状况分析。结果 (1) MM病人TNF两位点基因型频率、等位基因频率、联合单倍体分型中各型的频率与对照组比较差异均无统计学意义（P>0.05）；(2)比较MM病人两位点联合单倍体分型在不同性别、分期、肿瘤负荷、血红蛋白、血钙、血肌酐中的分布，没有发现显著性差异（P>0.05）；(3)用KaplanMeier方法进行生存分析，没有发现高危型与低危型的总生存时间有显著性差异：在高危型组和低危型组，2年生存率和4年生存率差异无统计学意义（P>0.05）；Cox回归模型显示两位点联合单倍体分型不是影响预后的危险因素（P>0.05）。结论 本组研究显示TNFα–308位、LTα+252位基因多态性在MM病人发病的易感性、临床和预后中可能不起重要作用。
【关键词】 多发性骨髓瘤 肿瘤坏死因子 基因多态性
0 引言
多发性骨髓瘤（multiple myeloma, MM）是来源于淋巴细胞系统的异常浆细胞过度增生的恶性肿瘤。有研究发现肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor alpha, TNF)可诱导MM细胞形成自分泌IL6环路；在骨髓，TNF与其它细胞因子形成一个细胞因子调控网络，调节MM细胞的生长。故一般认为，TNF可能与MM的发生或发展相关。淋巴毒素（LTα，又称为TNFβ）与TNFα同属一细胞因子家族，二者生物学效应类似。TNFα和LTα的基因多态性有可能通过影响这两种细胞因子的表达，进而影响MM的发生与发展。为探讨TNFα和LTα基因多态性与中国人MM发病、临床和预后的相关性，我们对32名MM患者的TNFα和LTα基因的单碱基突变多态性进行检测，了解上述基因位点在广东地区MM病人中的分布情况，并对其进行临床观察与随访研究。
1 材料与方法
1.1 研究对象 （1）MM组：32例，为2001年4月到2002年6月期间在中山大学第一附属医院、广东省人民医院住院确诊的MM患者, 年龄44～72岁，中位年龄59岁；（2）对照组：72例，选自同期献血员和中山大学第一附属医院教职工，其中男性43名、女性29 名，中位年龄24岁。上述所有观察对象均为广东汉族, 彼此间无亲缘关系。
1.2 TNFα、LTα基因目的片段多态性的检测
1.2.1 DNA提取 两组均取外周静脉血1ml, EDTA抗凝， NaI法抽提基因组DNA。 -80℃保存。
1.2.2 TNFα基因多态性片段的扩增 扩增含TNFα–308位多态性位点片段的正反引物是5′AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT3′和5′TCCTCCCTGCTCCGATTCCG3′。PCR扩增体系50μl，含10×Buffer 5μl（含1.5mmol/L MgCl2 ），2mmol/L dNTP 2.5μＬ，20mmol/L的正反引物各1μl，TaqDNA聚合酶（购自加拿大真达公司）2.5U，基因组DNA 100～150ng。先热启动，94℃预变性2min，再以下列温度和时间循环35次：94℃ 60s，60℃ 60s，72℃ 60s，最后再72℃ 延伸4min。循环中热盖温度103℃。扩增片段长度为107bp。
1.2.3 LTα基因多态性片段的扩增 扩增含LTα+252位多态性位点片段的正反引物分别是5′CTCCTGCACCTGCTGCCTGGATC3′和5′GAAGAGACGTTCAGGTGGTGTCAT3′。PCR扩增体系（50μl），除20mmol/l的正反引物各0.6μl外，其余与TNFα的扩增体系相同。先95℃预变性10min，再95℃ 60s，64℃ 60s，72℃ 120s，如此循环31次，循环中热盖温度103℃。扩增片段长度为368bp。
1.2.4 NcoⅠ限制性内切酶消化扩增片段 取PCR扩增产物10μl，加入限制性内切酶NcoⅠ（购自宝生物公司）8U，依说明书加入BSA、10×K Buffer两种缓冲液各2μl, 37℃孵育5h，孵育结束后加2μl 10×Loding Buffer终止反应。两基因酶切方法和过程相同。
1.2.5 凝胶电泳 TNFα消化产物以8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，恒压450V，电泳2.5h，0.012mol/l硝酸银染色后在凝胶上呈现深棕色条带，干胶保存。LTα消化产物以2.5% 琼脂糖凝胶电泳，100V 40min, 溴化乙锭（EB）染色，在紫外灯下观察结果，摄相保存。
1.3 诊断及随访
收集相关临床资料，分期、肿瘤量分级按多发性骨髓瘤诊断标准，制定追踪表，通过门诊或电话访问的形式了解疾病转归。每隔半年随访一次，随访截止时间是2003年4月。生存时间指从确诊至随访结束或死亡的时间。
1.4 统计学分析
采用SPSS 10.0计算机统计软件, 基因计数法计算各组基因型频率及等位基因频率；用Pearson 相关法分析两位点基因型间的相关关系；组间基因型、等位基因频率的比较及两位点联合单倍体分型与临床各指标间的关联性用卡方检验。用KaplanMeier方法进行生存分析，logrank方法进行差异检验。用Cox回归模型评估TNF–308位和+252位联合单倍体分型对疾病预后的影响。以双侧P<0.05为有意义的标准。
2 结果
2.1 基因型的确定结果
2.1.1 TNFα-308位点基因型的确定 含TNF1等位基因的一条链上有NcoI的识别位点，含TNF2等位基因的一条链上无该酶识别位点。故酶切电泳图谱显示为：TNF1/1纯合子的PCR产物被内切酶NocI完全切断，形成87bp和20bp两条片段，TNF1/2杂合子的PCR产物仅部分切断，形成107bp、87bp及20bp 3条片段，TNF2/2纯合子由于特异酶切位点的消失，其PCR产物因不能被切断仅形成107bp一个片段。
2.1.2 LT α+252位点基因型的确定 LT α（10.5）等位基因的一条链上无NcoI的识别位点，LT α（5.5）等位基因的一条链上有该酶识别位点。故酶切电泳图谱显示为：LT α（10.5/10.5）纯合子的PCR产物不能被内切酶NocI切断，仅形成368bp一个片段；LT α（10.5/5.5）杂合子的PCR产物仅部分切断，形成368bp、235bp及133bp 3条片段；LT α（5.5/5.5）纯合子能被内切酶Noc I完全切断，形成235bp和133bp两条片段。
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