【摘要】 目的 探讨乙酰肝素酶与大肠癌浸润、转移和血管生成之间的关系。方法 应用原位杂交方法检测乙酰肝素酶mRNA在95例大肠癌组织中的定位及表达。并用免疫组化方法对全部标本进行CD105染色，记数肿瘤微血管密度（microvessel density,MVD）,分析乙酰肝素酶mRNA表达与大肠癌浸润、转移和MVD之间的关系。结果 95例大肠癌组织中,乙酰肝素酶mRNA阳性表达49例（51.57％），MVD平均值为（72.1±20.6）；阴性表达46例（48.42％），MVD平均值为（41.3±12.4），差异有统计学意义(P<0.01)。乙酰肝素酶mRNA表达与大肠癌组织浸润深度、淋巴结转移 及MVD有关(P<0.05)。结论 乙酰肝素酶可促进大肠癌的浸润、转移和血管生成，可作为反映大肠癌生物学行为的客观指标。
【关键词】 乙酰肝素酶；大肠癌；血管生成；转移
乙酰肝素酶是近年来发现的肿瘤的重要功能酶,是体内惟一能够降解硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparin sulfate proteoglycan,HSPG)的一种βD葡萄糖醛酸内切酶，可以在特定部位裂解HSPG，促进肿瘤的浸润、转移和微血管形成[1]。 自从人类乙酰肝素酶基因被分离以来,人们发现它与许多恶性肿瘤的浸润转移和微血管形成有关[24]。大肠癌是消化道常见的恶性肿瘤之一,乙酰肝素酶mRNA表达是否与大肠癌的侵袭性生长、淋巴结转移和血管形成有关,国内尚未见报道。我们应用原位杂交方法，对95例大肠癌组织，进行乙酰肝素酶mRNA检测和肿瘤微血管免疫组化染色，计数肿瘤微血管密度（microvessel density ，MVD），探讨乙酰肝素酶与大肠癌浸润、转移和血管生成之间的关系。
1 资料和方法
1.1 标本来源 收集本校病理学教研室及开封市第一人民医院病理科2000～2004年大肠癌手术切除标本共95例，其中男58例，女37例，年龄25～70岁 ，平均（56±10.8）岁。所有病例术前未经任何化疗和放疗。肿瘤组织学分级分型均根据全国大肠癌病理研究统一规范，高分化癌15例，中分化癌45例，低分化癌35例；侵及至肌层者25例，侵及浆膜层及浆膜外者70例；Dukes分期属于A期10例，B期15例，C期62例，D期8例。大肠癌同时伴有淋巴结转移者63例，无淋巴结转移者32例。标本均经10%中性缓冲福尔马林固定，常规石蜡包埋，连续切片。检测mRNA标本所用载玻片均经APES处理，0.1％DEPC水浸泡。所用标本均经病理学明确诊断。
1.2 免疫组织化学染色 标本均经10%福尔马林固定，连续切片，分别作HE及免疫组化染色。CD105单克隆抗体由Santa Cruz生物技术公司生产。按常规SP 法进行，石蜡切片常规脱蜡至水后，微波抗原修复，0.3%H2O2甲醇封闭内源性过氧化物酶。DAB显色，苏木素复染、脱水、透明、封片、光镜下观察。每批染色均设阴性对照和阳性对照，阳性对照为已知阳性组织片，阴性对照用PBS代替一抗。
1.3 肿瘤MVD记数 参照 Weidner 等[5]报道的方法，以与背景明显有别的任何一个棕色染色的内皮细胞或细胞丛作为一个血管，只要结构不相连续，分支结构也作为一个血管计数。先在100倍光镜下寻找肿瘤中血管密度最高的5个区域，然后在400倍镜下记数MVD，5个区域的均值为该肿瘤的MVD值。
1.4 探针标记 采用Primer Premier 5.0软件设计反义寡核苷酸链，共35个bp (5′＞CTTGCCTCATCACCACTTCTATTCCCATTCGGCTT＜3′)，由上海生物工程公司合成。取1pmol量，采用德国保灵曼公司加尾寡核苷酸探针标记试剂盒，标记出1μg加尾反义寡核苷酸探针。
1.5 乙酰肝素酶mRNA原位杂交 ①组织切片预处理：切片66 ℃烤片过夜，至新鲜二甲苯中20min脱蜡，逐级0.1％DEPC稀释乙醇至水，0.2mo1/LHCl酸化，5m1/L蛋白酶K37℃消化20 min。0.01MPBS(pH7.4)冲洗3次。②杂交：在组织上滴加预杂交液，2×SSC湿盒内预杂交3h。每片组织滴加浓度为50ng/ml的乙酰肝素酶地高辛标记探针20μl，至2×SSC湿盒42℃杂交过夜。③洗涤、显色：杂交后分别用2×SSC、0.5×SSC、0.1×SSC洗涤5min×3次，37℃封闭20min，滴加生物素化鼠抗地高辛抗体，37℃、60min，0.01MPBS洗涤3次，滴加SABC 37℃、20min，DAB显色20min终止，充分水洗。苏木精复染，脱水、透明、封片。同时以子宫平滑肌瘤为阴性组织对照标本，黑色素瘤转移淋巴结为阳性对照，以预杂交液代替探针作为空白对照。
1.6 结果判断 原位杂交的阳性信号位于胞浆中，阳性信号为棕黄色，呈颗粒状。阳性细胞＜1％为阴性。
1.7 统计学处理 采用SPSS10.0软件进行分析，对实验结果采用χ2检验和t检验。
2 结果
2.1 乙酰肝素酶mRNA在大肠癌中的表达
用原位杂交法检测95例大肠癌组织。结果表明，乙酰肝素酶mRNA棕黄色颗粒阳性信号在癌细胞胞浆内。95例大肠癌组织中，阳性49例，阴性46例，阳性率为51.57％，见图1。
2.2 乙酰肝素酶mRNA表达与大肠癌侵袭性生长的关系
牙龈鳞癌中p65和VEGF的表达及意义
增殖抑制基因在结直肠癌中的表达及其意义