siRNA沉默HIF1α在缺氧状态下对食管鳞癌细胞VEGF表达的影响(1)-找论文网

作者：吴欣爱，孙燕，樊青霞，王留兴，王瑞林，赵培荣，张岚

【摘要】 目的观察体外乏氧培养条件下食管鳞癌细胞系EC9706中HIF1α和VEGF的表达，探讨HIF1α在低氧条件下对食管鳞癌血管生成的调控作用。方法 CoCl2化学缺氧法模拟肿瘤缺氧环境，RTPCR、免疫组化法和免疫印迹法分别检测缺氧状态下HIF1α和VEGF在mRNA和蛋白水平的表达。采用化学合成小干扰RNA（siRNA）介导的RNA干扰技术（RNAi）用siRNA转染EC9706细胞。观察转染后HIF1α沉默效果。结果低氧条件下，EC9706细胞HIF1α mRNA水平稳定，蛋白表达显著升高，而VEGF mRNA和蛋白的表达均显著升高。SiRNA转染EC9706后能够显著下调HIF1α的基因表达，同时VEGF基因的表达也受到明显抑制。结论缺氧促使EC9706细胞HIF1α在蛋白水平表达升高，并通过转录激活VEGF的机制调控食管鳞癌血管生成。

【关键词】 食管鳞癌;乏氧诱导因子1α;血管内皮生长因子;双链RNA;RNA干扰

恶性肿瘤快速生长和肿瘤内部血液供应相对不足导致肿瘤内部形成缺氧微环境。低氧是实体肿瘤微环境的基本特征之一。缺氧条件下，肿瘤细胞内许多基因的转录和表达发生变化，对缺氧作出应激反应。引起肿瘤的侵袭性增加和对放化疗的抗拒性增加，而在这个过程中转录因子乏氧诱导因子1 （hypoxiainducible factor 1 alpha,HIF1α）起中枢纽带作用[1]。乏氧引起的一些酶或因子的变化大多是通过HIF1α起作用。其在食管癌血管生成中的调控作用，尚未见详细报道。本研究以食管鳞癌细胞系EC9706为研究对象，通过体外模拟肿瘤缺氧微环境，利用RNA干扰技术观察小干扰RNA转染EC9706细胞前后低氧条件下HIF1α和VEGF的表达，初步探讨HIF1α在缺氧条件下对食管癌血管生成的调控作用。

1 材料和方法

1.1 材料

食管鳞癌细胞系EC9706由中国医学科学院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验王明荣教授惠赠。HIF1α siRNA(h)、Control siRNAA 、siRNA转染试剂及HIF1α抗体均购自Santa Cruz公司。RTPCR试剂盒购自大连宝生物工程有限公司，VEGF抗体购自武汉博士德公司，SP免疫组化试剂盒购自北京中杉生物技术公司

1.2 方法

1.2.1 细胞体外乏氧培养条件的建立

EC9706细胞用含10%新生牛血清的RPMI1640培养基，于37℃、5%CO2培养箱中培养。化学缺氧剂CoCl2加入培养基的终浓度为75μmol/L，用于模拟肿瘤内部缺氧微环境。

1.2.2 半定量RTPCR检测mRNA表达

EC9706细胞于低氧条件下培养8h，Trizol法提取细胞总RNA，逆转录反应体系（20μl）组成为：DEPC水7μl，5×Buffer 4μl，dNTPs（10nM）2μl，Oligo（dT）1μl，RNase抑制剂 1μl，总RNA 4μl，逆转录酶1μl，37℃ 5min， 42℃ 1h，70℃10min灭活逆转录酶。PCR引物序列如下：HIF1α上游5′ CCT GCA CTC AAT CAA GAA GTT GC 3′，下游5′ TTC CTG CTC TGT TTG GTG AGG CT 3′（618bp）；VEGF上游5′ CAC ATA GGA GAG ATG AGC 3′，下游5′ CCG CCT CGG CTT GTC ACA 3′（230bp）；βactin上游5’ CAT CCT GCG TCT GAC CT 3’,下游5’ TCA GGA GGA GCA ATG ATC TTG 3’(480bp)。2%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，数码照相并行灰度值分析。

1.2.3 免疫组化SP法检测低氧条件下HIF1、VEGF蛋白的表达

缺氧处理8h后收获细胞爬片，4%多聚甲醛固定10min，按照试剂盒说明进行。HIF1α、VEGF多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，SP试剂盒购自中杉生物技术有限公司。

1.2.4 siRNA转染EC9706细胞

转染前24h 以 4×105/ml密度接种细胞于6孔培养板，待细胞生长至60%～70%融合时进行转染。按试剂盒说明进行。分别设siRNA转染组及Control siRNA组。转染32h后，更换含化学缺氧剂CoCl2培养基继续培养8h，收集细胞进行相关指标检测。

1.2.5 HIF1α基因沉默效果的测定

低氧培养4、8h后，分别提取未转染组、转染阴性对照组和转染组的细胞蛋白考马斯亮蓝蛋白定量。10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白后，380V转移30min，凝胶上的蛋白转移至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉封闭过夜，加入HIF1α抗（1∶1000稀释），37℃孵育2h，PBS漂洗，在封闭液中加入辣根酶标记的羊抗兔二抗，37℃孵育1h，PBS漂洗。最后用ECLPLUS试剂孵育，胶片曝光显示特异电泳条带，照相，行图像分析。HIF1α抑制率=（未转染组灰度值RNA干扰组灰度值）/未转染组灰度值×100%。

1.2.6 HIF1α基因沉默后对VEGF表达的影响

分别采用RTPCR及免疫组化法检测转染后EC9706细胞VEGF mRNA水平及蛋白水平的变化。

1.3 统计学分析

采用SPSS统计软件，配对组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 缺氧HIF1α、VEGF mRNA表达的变化

缺氧处理8h后，提取培养细胞的总RNA，RTPCR检测HIF1α、VEGF、mRNA的表达情况，结果显示：EC9706细胞中HIF1α mRNA常氧条件存在表达，缺氧8h后，其表达没有明显改变（P>0.01)，见图1A。而VEGF mRNA的表达在缺氧后显著升高。缺氧8h后，VEGF、mRNA的表达提高了6.12倍（P<0.01），见图1B。

2.2 缺氧对HIF1α、VEGF蛋白表达的影响

免疫组化法表明：常氧条件下，EC9706细胞HIF1α蛋白表达阴性，VEGF呈弱阳性，蛋白表达定位于胞浆。缺氧8h后，HIF1α表达呈强阳性，可见强棕黄染颗粒定位于胞浆和(或)胞核，VEGF蛋白表达也明显增强,见图2。

2.3 siRNA对HIF1α蛋白表达的影响

采用免疫印迹（Western blot）定量分析乏氧条件下HIF1α蛋白表达及RNA干扰的效果。结果显示：乏氧4h HIF1α蛋白即可稳定高表达,见图3。siRNA转染细胞后，HIF1α蛋白表达明显降低，HIF1α表达抑制率为90%，而未转染组及转染阴性对照组HIF1α蛋白没有明显改变，见图4。免疫组化法显示siRNA转染后，细胞染色明显减弱，仅见个别细胞着色，见图5。

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