作者：张秋实,李继俊,赵兴波
【摘要】 目的 观察抗孕激素米非司酮对人子宫内膜癌细胞体外增殖活性的影响，并探讨其作用机制。方法 体外培养子宫内膜癌HHUA细胞株，不同浓度米非司酮处理细胞24～96h，应用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法观察米非司酮对HHUA细胞增殖活性的影响；免疫组化技术观察HHUA细胞Ki67和cmyc基因表达的变化。结果 米非司酮以时间剂量依赖性方式，显著地抑制人子宫内膜癌HHUA细胞的体外增殖活性（P<0.05）；当米非司酮浓度≥5μmol/L作用细胞24h后，子宫内膜癌HHUA细胞Ki67和cmyc基因表达水平明显降低。结论 抗孕激素米非司酮以时间剂量依赖性方式显著抑制子宫内膜癌HHUA细胞的体外增殖活性，并与降调Ki67和cmyc基因表达密切相关。
【关键词】 米非司酮;子宫内膜癌;增殖活性;基因
近年有关抗雌激素三苯氧胺和抗孕激素米非司酮及其衍生物用于子宫内膜癌治疗的研究已见报道，但对于米非司酮治疗子宫内膜癌细胞作用的分子学基础研究相对较少，本研究拟通过观测抗孕激素米非司酮 （mifepristone）对人子宫内膜癌HHUA细胞体外抗增殖作用，在细胞分子生物学水平，从细胞增殖活性、基因表达方面探讨米非司酮抑制子宫内膜癌细胞体外增殖的作用机制，为临床上应用抗孕激素药物治疗子宫内膜癌提供实验依据。表1 不同浓度米非司酮处理HHUA细胞24～96h生长抑制率（以5μmol/L组为例）vs 0.1μmol/L组和1μmol/L组，*P<0.01；各组间两两比较，P<0.05
1 材料与方法
1.1 材料
人子宫内膜癌细胞系HHUA为高分化子宫内膜腺癌细胞，含有17β雌二醇受体和孕激素受体以及野生型p53、p21等基因，由山东大学荣凤年博士惠赠。
1.2 实验试剂与药物
米非司酮（RU486）纯品由北京第三制药厂提供。甲基偶氮唑蓝（MTT）为美国Sigma公司产品。鼠抗人Ki67和cmyc单克隆抗体为美国Santa Cruz公司产品，免疫组化染色试剂盒（ HistostainPlus Kits）购自北京中山生物技术有限公司。
1.3 方法
人子宫内膜癌HHUA细胞在含有RPMI1640培养液（含10%胎牛血清）的96孔培养板中37℃、饱和湿度、5％CO2、恒温培养24h，加入不同浓度米非司酮使其终浓度分别为0（对照）、0.1、1、5、10、50和100μmol/L。每孔中总体积为200μl，每种药物每种浓度设置5个复孔，继续培养24～96h后，每孔加入配制好的MTT（5mg/ml）20μl，培养箱内继续培养4h，酶标仪测定每孔的吸光度A值（波长分别为560nm和630nm），计算细胞生长抑制率＝（1-实验组A值/对照组A值）×100％。
在每孔底面铺有洁净小玻片的12孔培养板中用上述方法培养子宫内膜癌HHUA细胞24h，每孔换入含有米非司酮5μmol/L，10μmol/L的培养液，同时设立阴性对照孔，培养箱中继续培养24h，取出小玻片用纯丙酮固定20min，严格按免疫组化操作程序进行SABC法染色。
1.4 染色结果判断
参照AnsariLari等[1]的判断标准，按AB值法进行光镜分析表达强度。
1.5 统计学处理
实验数据采用SAS 6.12软件进行方差分析及t检验。
2 结果
2.1 米非司酮对子宫内膜癌HHUA细胞生长的抑制作用
MTT法检测发现，在米非司酮≥5μmol/L时，HHUA细胞随药物作用时间的延长，生长抑制作用呈现增强趋势，差异有统计学意义（P<0.05）；增高米非司酮浓度≥5μmol/L，细胞生长抑制率也随之上升，差异有统计学意义（P<0.05）。呈现出明显的时间浓度依赖关系,见表1，图1。
2.2 米非司酮对子宫内膜癌HHUA细胞Ki67和cmyc基因表达的作用
米非司酮5μmol/L作用HHUA细胞24小时后，免疫组化检测细胞Ki67和cmyc基因表达明显下调，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）；增大米非司酮10μmol/L，未见到HHUA细胞Ki67和cmyc基因表达下调出现增强的趋势，但与对照组相比，差异有统计学意义（P<0.05）,见表2，图2、3。表2 米非司酮作用子宫内膜癌HHUA细胞24小时Ki67、cmyc基因表达变化
低位直肠癌手术并发症的原因分析及处理
热疗联合化疗治疗晚期非小细胞肺癌研究进展