【摘要】 优化骨髓间质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)体外分离培养技术，改良生物材料聚乙醇酸-乳酸共聚物(poly lactideco glycolide，PLGA)的细胞黏附性，观察BMSCs与Ⅱ型胶原修饰的PLGA的黏附性。［方法］密度梯度离心法分离BMSCs，流式细胞分析法(FACS)对细胞表面抗原、细胞活力、细胞周期进行检测，相差显微镜观察细胞形态。相分离法制做PLGA，Ⅱ型胶原进行表面修饰，取第三代干细胞与PLGA附和，扫描电镜观察细胞与材料的黏附情况。［结果］BMSCs可在体外分离扩增，表达CD29、CD44和CD106，不表达CD34和CD45，细胞活力为88.96％，G0G1细胞占90.32％。细胞形态为长梭形，Ⅱ型胶原表面修饰的PLGA平均孔径为100 μm，与BMSCs有较好的黏附性。［结论］BMSCs可在体外长期、稳定培养，是理想的组织工程种子细胞。Ⅱ型胶原表面修饰的PLGA与干细胞有较好的黏附性，可用来做组织工程生物材料。
【关键词】 骨髓间质干细胞 PLGA 组织工程
Abstract：［Objective］To explore a method for isolating and culturing bone marrow mesenchymal stem cell (BMSCs) in vitro, and improve the cellular conglutination ability of biomaterial polylactidecoglycolic acid (PLGA),and observer the adhesion of BMSCs cultured on PLGA modified with Ⅱ collagen.［Method］BMSCs were isolated and cultured in vitro.The cell exterior antigen, cell livingness and cell cycle were analyzed by flow cytometry method, and cellular configuration was observed continually under invertd phasecontrast microscope.PLGA was made by phase separation, and was modified with Ⅱ collagen. The third era BMSCs were cultured on PLGA,and its adhesion with biomaterial was observed scan electron microscope.［Result］BMSCs could be isolated and cultured in vitro, and express CD29, CD44,CD106, but not express CD34, CD45. The cell livingness was 88.96%, cells in G0Glperiod are 90.32%. The cell morphology was spindle. The average diameter of PLGA modified with Ⅱ collagen was 100 μm, and PLGA has good adhesion with BMSCs.［Conclusion］BMSCs could be cultured stability in vitro for long time, and is good seminal cell of tissue engineering.Ⅱ collagen can improve the cellular adhesion of PLGA, PLGA modified with Ⅱ collagen is the good biomaterial of tissue engineering.
Key words：bone marrow mesenchymal stem cell; PLGA; tissue engineering
组织工程修复受损组织的基本方法就是将种子细胞种植于生物支架材料上，经体外培养一定时间后再植入体内达到修复和重建受损组织的目的，所以细胞与生物支架材料的黏附性就成了构建组织工程化组织和器官的关键问题之一。本研究将体外提纯，扩增的BMSCs种植到经Ⅱ型胶原修饰的PLGA材料上联合培养，扫描电镜观察其黏附情况，观察Ⅱ型胶原修饰的PLGA材料的细胞亲和性，探索以BMSC为种子细胞，以Ⅱ型胶原修饰的PLGA为生物支架材料构建组织工程的可行性，为临床组织工程的应用研究提供理论和实验数据。
1 材料和方法
1.1 材料和仪器
SD大鼠(广东省动物中心)；PLGA(济南迈康公司，分子量10万单位)；胎牛血清(FBS)、淋巴细胞分离液(天津TBD公司)；DMEM(Dulbecdo minimum essential medium)干粉培养基、胰蛋白酶、Ⅱ型胶原(Sigma公司)；流式细胞仪FACS Aria(美国BD公司)；CD29FITC、CD44FITC、CD106PE、CD34PE和CD45FITC(Ancell公司)；PI(Sigma公司)；扫描电镜(日立公司，日本)。
1.2 PLGA的制备合成及扫描电镜观察
70∶25的PLGA溶解于二氧六环匀速搅拌3 h，溶液浇铸平皿上，-20℃放置过夜，放入质量比为30∶70的酒精溶液中萃取8 h，连续3次，将结块样品放入真空机冷冻干燥。制备成10 mm×10 mm×5 mm大小的样品，将上述得到的样品10个放入含5 mg Ⅱ型胶原的5 ml PBS溶液中振荡混合1 h，入真空机冷冻干燥。质量法测定其孔隙率［1］。取小块PLGA材料，固定于2％的戊二醛24 h，0.1 mol/L PBS(pH7.2)洗3次，不同梯度酒精逐级干燥，样品镀金，电镜扫描。
1.3 BMSCs的体外培养
1个月龄SD大鼠，脱颈处死，取双侧股骨，剔净软组织，75％酒精浸泡消毒5 min，PBS洗2次，剪断股骨一端后，用带5号针头的注射器将体积分数为10％胎牛血清的DMEM(含100 U／ml青霉素、100 μg／ml链霉素和20 U／ml肝素)冲洗股骨骨髓腔，取混合骨髓液4 ml缓慢注入事先准备好的含6 ml的淋巴细胞分离液的离心管内，800 g离心20 min，取出中间层的单核细胞接种于25 cm2培养瓶，37℃、5％CO2培养箱静置培养。5 d后首次换液，以后每隔3 d换液，长满后传代，取P3细胞进行实验。
1.4 BMSCs的形态学观察
原代及传代培养的细胞，用倒置相差显微镜逐日观察细胞生长、增殖情况及形态特征。
1.5 BMSCs的鉴定
FACS检测BMSCs的表面抗原，将对数生长期的P４细胞消化分离(37℃，3～5 min)，收集细胞制成1×106个细胞／ml的细胞悬液。加入500 μl适当稀释度的FITC标记抗人CD29、CD44、CD45单克隆抗体，PE标记抗人CD34和CD106单克隆抗体，反应30 min后检测。
1.6 BMSCs的生长曲线，细胞周期及活力的检测
取P1、P3、P5的细胞以104个细胞／ml接种于24孔培养板内，每天同一时间消化3孔计数，连续计数8 d绘制生长曲线。收集P3细胞，制成1×106个细胞／ml的细胞悬液，FACS对BMSCs的细胞活力和细胞周期进行检测。
1.7 BMSCs与Ⅱ型胶原修饰的PLGA复合
取P3细胞，调整浓度为106个细胞／ml。已制作好的支架材料经60Co消毒后用无菌DMEM培养基反复冲洗，培养箱内晾干，把PLGA放于24孔板的孔底，滴加100 μl的细胞悬液，培养1 h后翻转，再在另一面滴加100 μl细胞悬液，培养1 h后加培养基淹没整个基质材料，每周换液2次，体外培养2周，分别在复合后1、7、14 d取材，作扫描电镜观察。
2 结 果
2.1 Ⅱ型胶原修饰的PLGA扫描电镜观察
合成的复合PLGA为多孔的三维立体结构，电镜扫描可见：PLGA内部形成大小不一的大孔和互连的小孔，彼此相互交通，支架四处均可见白色的微小Ⅱ型胶原颗粒(图1)。应用质量法测得的孔隙率为90％，孔径在50～200 μm之间，平均孔径为100 μm。
2.2 BMSCs形态学观察
原代细胞的观察：刚接种的细胞呈球形悬浮于培养液中，8～10 h开始逐渐沉降贴壁，48 h少数贴壁细胞呈成纤维细胞样外形，3～5 d贴壁细胞开始增殖呈克隆生长，5～7 d后部分细胞成细胞团簇，细胞多为梭形，胞核明显为卵圆形或圆形。可见1～3个核仁，胞质丰富、胞浆清晰。原代培养12 d可长满瓶底。培养液中的渣滓随换液被逐渐清除。
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