体内构建骨软骨复合体修复骨软骨缺损的实验研究(1)-找论文网

【摘要】 探讨软骨组织工程方法修复骨软骨缺损理想的种子细胞和支架材料。［方法］体外诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞定向分化，分别与PLGA支架复合培养，并模仿马赛克骨软骨移植术在犬关节骨软骨缺损深层置入MSC－支架复合体，浅层置入诱导培养后的MSC－支架复合体，紧密压配，体内构建骨软骨复合体，观察其修复的情况。［结果］16周实验组缺损区完全由透明软骨修复，与周围正常软骨完全融合，组织观察显示以软骨细胞修复为主，软骨下骨形成，潮线基本恢复；阴性对照组缺损区主要由纤维组织修复，部分由透明软骨修复，组织观察显示以纤维细胞修复为主，混有部分软骨细胞；空白对照组完全由纤维组织修复。［结论］MSCs经向软骨细胞定向分化后复合PLGA支架材料，通过紧密压配方式与MSCs－PLGA支架在体内构建骨软骨复合体，可以有效修复骨软骨缺损。

【关键词】 骨髓基质干细胞马赛克移植术骨软骨复合体骨软骨缺损

Abstract：［Objective］To evaluate the effect of treating the osteochondral defects with implanted cellscaffold composites, cultured MSCs as seed cells and PLGA as scaffolds,and to acquire desirable seed cells and scaffold materials.［Method］BMSCs were induced to differenciatiated into chondrocytes, cocultured with PLGA scaffold respectively in vitro, then implanted into osteochondral defects on canine models by using techniques of mosaicplasty, induced BMSCPLGA scaffold composites in the top of the defect and BMSCPLGA scaffold composites in the bottom of the defect, osteochondral composites were constructed in vivo, and repair was observed with naked eyes and histology.［Result］At 16 weeks after transplantation the defects of expeirmental group were covered with semitransparent smooth white tissue and the margins between the repair tissue and the surrounding cartilage were not recognized. Histologically, most of the repair tissue was consisted with chondrocytes, maintained their thickness to the full depth of the original defects. The subchondral bone was well remodeled. The tidemark was observed. The defects of positive control group were covered with repair tissues, and partial were conformed with original cartilage. The repair tissue was partly filled with chondrocytes. However, the defects of negative control group were repaired with soft fibrous tissues without luster, and an obvious boundary between reparative and original cartilage was seen.［Conclusion］MSCsPLGA scaffold composites, constructed into osteochondral composites by suppressing closely in vivo,are the ideal materials for repairing cartilage defects.

Key words：bone mesenchymal stem cells(MSCs); mosaicplasty; osteochondral composites; osteochondral defect

关节软骨损伤是骨科临床的常见疾病，以往临床使用的治疗方法均难以达到理想的要求。组织工程技术的迅速发展，为这一难题的解决提供了前所未有的机遇。本实验研究的目的是采用软骨组织工程技术，体外分离骨髓间充质干细胞（MSCs）为种子细胞，经软骨细胞诱导生长因子的诱导培养后，与聚羟基乙酸（poly glycolic acid， PLA）－聚乳酸（poly lactic acid， PGA）共聚物(PLGA)支架材料复合培养，并模仿马赛克骨软骨移植术在犬膝关节骨软骨缺损深层置入MSC－支架复合体，浅层置入诱导培养后的软骨细胞－支架复合体，紧密压配，体内构建骨软骨复合体，观察其修复的情况。期望能够找到软骨组织工程理想的种子细胞和支架材料。

1 材料和方法

1. 1 材料

1. 1. 1 种子细胞 10～12个月龄健康比格犬，无菌穿刺抽取髂骨骨髓7～8 ml，Percoll分离法分离骨髓间充质干细胞，进行原代、传代细胞培养。

1. 1. 2 支架材料将PLGA支架(购自山东医疗器械研究所)剪成1. 0 cm×1. 0 cm×0. 2 cm大小的方块，放入12孔板内，然后经紫外线照射30 min消毒，备用。

1. 1. 3 受体动物及分组 10～12个月龄健康比格犬10只（购自山东大学动物实验中心），体重在8～10 kg。在每只犬的双侧膝关节分别制造3个骨软骨缺损区，随机分为3组。A组：实验组关节软骨缺损内深层植入MSCs复合PLGA支架材料，浅层植入经过诱导培养的软骨细胞复合PLGA支架材料，紧密压配；B组：阴性对照组，缺损内仅植入MSCs复合PLGA支架材料；C组：阳性对照组，缺损内不植入任何材料。

1. 1. 4 主要试剂一抗：兔抗人Ⅱ型胶原抗体，二抗:山羊抗兔IgG，DAB显色试剂盒，以上均购自武汉博士德公司。

1. 2 方法

1. 2. 1 MSCs向软骨细胞定向分化 P1传代细胞培养至细胞铺满瓶底时，消化后调整细胞浓度，加入含TGFβ110 ng/ml、10％胎牛血清的低糖DMEM溶液诱导培养。

1. 2. 2 诱导MSCs的鉴定（1）糖胺聚糖（GAG）检测（表1）。取传代培养第二代MSCs（P2），实验组加入TGFβ1诱导培养，对照组用常规培养液培养，待细胞长满全层时，胰酶消化，调整细胞浓度为1×104/ml，接种于96孔板每孔200 μl，继续加入含不同的培养液每孔200 μl，每组5孔，培养第3 d换液1次，第7 d（诱导培养后第15 d）时，取细胞培养上清液，以硫酸软骨素为标准品，紫外分光光度计制作标准曲线，阿利新蓝法检测细胞培养上清液中GAG含量；（2）Ⅱ型胶原免疫组化按试剂盒说明书进行操作，Ⅱ型胶原阳性的细胞，胞浆着色呈黄色或棕黄色（表2）。表1 细胞因子对MSCs分泌糖胺聚糖（GAG）的检测表2 Ⅱ型胶原免疫组化阳性细胞数（个/视野）

1. 2. 3 细胞－支架复合体的构建及其体外培养将上述2种细胞悬液调整浓度后，滴加到PLGA支架上，37℃、5％CO2孵箱培养。继续各用原培养液进行培养7～8 d，备扫描电镜检查和动物实验。

1. 2. 4 复合体移植 10～12个月龄健康比格犬10只，静脉麻醉成功后，术区准备完毕后，取膝关节内侧切口，显露膝关节，在膝关节股骨滑车处，用手摇钻制作一个直径为5 mm的圆柱形软骨缺损区，深达软骨下骨，平均深为5 mm。按照分组情况，A组：软骨缺损处先在深层植入未诱导分化组的MSCs －PLGA复合体，再在浅层植入诱导分化组的软骨细胞－PLGA复合体，紧密压配；B组：缺损处全层植入未诱导分化组的MSCs－PLGA复合体；C组：空白对照，只造成缺损不植入任何材料。严密缝合关节囊。术后分笼饲养，自由活动。

1. 2. 5 大体观察分别于术后12、16周取材，观察缺损区软骨生长情况。

1. 2. 6 组织学观察

2 结果

2. 1 细胞形态学改变

倒置相差显微镜观察发现，原代细胞接种后1～3 d可见少量细胞贴壁，呈短梭形。3 d后出现细胞集落，7～8　d广泛集落形成。12～14 d细胞形成单层。传代细胞贴壁快，7～8 d形成单层，细胞核大，胞浆内颗粒多。加入细胞因子后，细胞生长明显加快，体积增大，胞体变圆，呈漩涡状生长；

2. 2 实验组

MTT吸光度值、培养上清液中的糖胺聚糖（GAG）含量和Ⅱ型胶原分泌均明显高于对照组。Ⅱ型胶原免疫组化阳性的MSCs胞浆染色为黄色或棕黄色(图1、2)。

2. 3 电镜观察

扫描电镜显示PLGA支架呈不规则多孔状，孔径控制在200～300 μm，孔径率85%，孔壁厚度较均匀,为20～40 μm。复合材料显示MSCs细胞在PLGA支架上的黏附、伸展和增殖良好，可以见到细胞分泌的基质和细胞伪足的铆固作用(图3)，表明支架材料具有良好的细胞亲和性。

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成人肱骨远端骨折的手术治疗分析