2. 4 动物实验结果
大体观察。术后12周：A组新生组织表面平整、光滑，与周围软骨界线模糊，端面显示软骨厚度与正常软骨相近；B组修复高度较周围软骨水平相近，但软骨层厚度比A组明显偏薄，无光泽，与周围软骨界线尚清楚；C组部分接近正常修复高度，修复组织呈黄色，局部凹陷。术后16周，A组缺损修复区组织与周围关节软骨相整合，软骨缺损区被光滑白色半透明的组织覆盖，与周围软骨组织外形无差异(图4)；B组缺损区修复组织与周围软骨部分整合在一起，光泽较差(图4)；C组缺损处修复组织低凹新生组织软，无光泽，与周围软骨组织区别明显。
组织学观察。术后12周：A组缺损区形成透明样软骨组织，比周围正常软骨偏厚，软骨细胞数量多，出现明显的规律，表面层的软骨细胞平行关节面排列，深层纵向排列，软骨基质染色较四周时淡，软骨下骨丰富。B组边缘区厚度与周围正常软骨接近，软骨细胞排列不规则，与周围软骨结合可，无明显裂隙存在。近中央区仍以纤维组织修复为主，细胞数很少，局部有裂隙。C组表面为纤维组织，细胞成分较少。术后16周，A组缺损区软骨厚度与正常软骨组织接近，细胞排列出现明显规律，表面层的软骨细胞平行关节面排列，深层纵向排列，与透明软骨组织相似，软骨下骨形成，潮线基本恢复，与周围正常软骨连接较好(图5)。B组软骨细胞排列不规则，中央修复区大部分为纤维组织修复(图6)。C组缺损区内主要为纤维组织(图7)。
2. 5 统计学分析
采用SPSS10. 0统计软件包分析，数值以±s表示，以P＜0. 05表示差异有显著性意义。表3 关节软骨缺损的组织学评分标准表4 各组软骨修复组织学评分结果 各时间段A组与B组、C组比较均有显著性差异，*P＜0.05。
3 讨 论
有研究认为对于微环境尚未受到严重破坏的组织修复或再生治疗，不需要进行体外诱导即可用干细胞直接移植修复，而对于缺损或微环境严重受损的组织修复或再生治疗，则需要对干细胞进行定向诱导后移植［1］。作者的实验结果表明，在体外对MSCs进行诱导培养，(1)可以使细胞扩增；(2)可以向软骨细胞定向分化。在体外构建成熟的组织工程化软骨，是在模拟体内微环境的条件，探索和研究软骨种子细胞在支架内黏附、增殖及种子细胞与支架材料的相容性即软骨形成的条件、机制的问题。作者把细胞－PLGA支架复合体在体外培养1周后，塑成圆柱状，采用马赛克移植方法植入缺损部位，底部为MSCsPLGA支架复合体，表层部分为诱导培养的MSCsPLGA支架复合体。在体内微环境的作用下，迅速生成软骨组织。在12周时，软骨组织已充满了整个缺损区，随后深层软骨组织逐渐被软骨下骨替代。16周时软骨细胞出现分层排列，与周围正常组织无明显差别。在制造骨软骨缺损模型的时候，损伤区会释放生物活性因子，包括TGFβ、IGF1和BMP［2］。早期复合组织植入缺损部位后，在这些细胞因子的作用下，经诱导的MSCs细胞在PLGA支架材料中迅速增殖，表层的复合体在关节内滑液细胞因子和周围软骨组织微环境的作用下形成早期软骨组织。而深部的复合体被来自于损伤区的血管组织侵入，机体的MSCs细胞和诱导植入的MSCs细胞，在局部微环境的作用下，形成骨组织－软骨下骨，从而完成骨软骨缺损组织的修复。这种修复的特点是软骨与软骨下骨形成坚固的自然连接，软骨下骨与软骨同时获得修复。但是作者某些切片中观察到2种复合体之间有裂隙、整合差，但深部复合体与软骨下骨的结合均良好。
尽管很多专家学者在体内、体外均成功构建出骨软骨复合组织［3～7］,但是存在以下问题:(1)无论在体外或体内,构建组织的骨、软骨界面结合欠佳；（２）植入软骨与周围宿主软骨组织整合欠佳；(3)形成的软骨组织质量缺陷:透明软骨比例少,缺乏正常关节软骨的分层结构,缺乏表浅的扁平细胞层和潮标等；（４）更为重要的是,以上构建的骨软骨复合组织只是短期观察有证据初步表明在形态学、生化成分等方面具有骨软骨组织结构,其生理功能、机械性能、能否长期持续存在等尚待进一步研究证实。为了改善骨软骨复合组织的结构和界面形成情况,设计一体化、呈梯度变化的双层支架材料将更为有利。She rwood等［8］应用TheriForm三维打印方法研制出一种新型的骨软骨三维支架,在骨、软骨端配件交界区组成成分含量、气孔率等方面形成梯度变化,这样可以避免支架在体外培养和体内植入时发生界面分层而有利于新生的骨与软骨组织之间形成良好界面。
本实验结果证实：MSCs适合成为软骨组织工程的种子细胞。取材方便，体外培养性能稳定，易于传代扩增，在一定诱导条件的培养下，可以分化为软骨细胞。TGFβ1在促进MSCs细胞增殖和向软骨细胞定向分化方面有显著的作用。PLGA支架是理想的软骨组织工程支架材料，具有良好的孔隙率和组织相容性，MSCs在其中可以很好地黏附、扩展和增殖。MSCs经向软骨细胞定向分化后复合PLGA支架材料，通过紧密压配方式与MSCs－PLGA支架在体内构建骨软骨复合体，可以有效修复骨软骨缺损。
图1 对照组 MSCs免疫组化结果阴性，胞浆内未见到棕褐色颗粒 图2 实验组MSCs免疫组化结果呈阳性，胞浆内见有棕黄色颗粒 图3 细胞在支架材料上黏附、增殖，形成细胞团，借伪足锚固于支架上 图4 A组（黄箭头）修复软骨厚度较B组（绿箭头）厚，与周围组织边界不清，需仔细辨认（4个月后） 图5 A组缺损区软骨下骨结合紧密，潮线形成，与周围软骨组织融合好（4个月后×20） 图6 B组缺损由纤维组织修复，细胞排列规律，与软骨下骨结合尚可，局部有裂隙（4个月×10） 图7 C组缺损部分纤维组织，排列杂乱，见分泌基质。
【参考文献】
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