体外制造的钴铬钼合金颗粒也有片状、盘状、柱状、针状等各种不规则形状，钴铬钼合金颗粒更多为块状颗粒，是由于颗粒轻度聚集，显得体积更大（图6）。
与体内分离颗粒对照发现，颗粒的形态均非常近似，表面都有蛋白沉积。体内分离颗粒大小分布更加不均匀（图 7）。
2. 4 巨噬细胞培养与吞噬实验
J774A. 1巨噬细胞经合适的条件培养24 h后细胞生长旺盛，吞噬活性较强。倒置相差显微镜下细胞成圆形或椭圆形，细胞轮廓清晰，胞浆内无明显吞噬小体（图8）。与体外制备的钴铬钼颗粒共同培养24 h后，镜下细胞形态发生变化。细胞密度减小，细胞肿胀成圆形，胞核变大，甚至见到细胞大片坏死，核溶解，细胞碎裂，胞浆内有被吞噬的钴铬钼颗粒影像（图9）。
2. 5 培养的巨噬细胞透射电镜观察
当金属颗粒接近J774A. 1巨噬细胞时，细胞伸出伪足逐渐将较小的颗粒吞噬入细胞内。此时细胞开始张大，胞浆内线粒体和粗面内质网增生，表示分泌活动活跃，颗粒进入细胞成为吞噬体。胞浆密度变得不均匀，有空泡样变（图10）。
3 讨 论
为阐明假体松动的机理和对新型假体材料的生物相容性进行评价，众多学者采用体外细胞培养、组织培养、体内植入等方法对颗粒引发的生物学反应进行研究［5～7］。由于体内颗粒来源有限，国内学者常采用简单的材料对磨、过筛或接受国外赠送的方法体外获得颗粒，而国外学者采用的方法有对磨（milling）、金属熔体雾化（aerosolization）、气化（gas atomization）、激光制粉法等［4］。由于来源杂乱，颗粒的各项特性变异较大，使大量的实验数据因无法重复和比较而失去实际意义。如何体外产生生物金属的颗粒并使之能很好地模拟体内颗粒是一个普遍地急需解决的问题。
大量的研究已经显示：磨损颗粒的物理、化学性质是影响机体反应程度和假体松动的关键因素。这些性质包括：颗粒数量、大小、粒度分布、表面积、化学元素构成、表面形态、可溶性金属离子释放、表面电荷等［5］。使体外生成的颗粒最大限度地模拟体内磨损颗粒是作者设计这个方法时始终坚持的原则。
3. 1 颗粒的产生方法
人工关节周围的金属磨损颗粒可以来源于关节面、柄-骨界面、假体-骨水泥界面、臼杯-骨界面、组合式假体的柄-头结合处。从磨损机理上讲属于表面摩擦磨损，因此借鉴工业球磨的方法产生颗粒是合理的。作者自行设计的球磨罐具有以下特点：(1)采用相同的材料加工球磨罐和磨块，无焊接工艺和罐口的密封装置避免了任何其它材料参与摩擦，保证了颗粒的纯净；(2)润滑液采用PBS+2%小牛血清+5 IU/ml青霉素+5 μg/ml链霉素，动物血清对颗粒进行预孵化(preincubation)，经蛋白孵化的颗粒的生物学行为更接近体内颗粒。在实践中作者发现，预孵化过程能在颗粒表面形成蛋白保护膜，明显减少颗粒的聚集成团现象，有利于颗粒的离心分离和电镜观察；(3)本装置的所有组件按ASTM F86-76标准进行清洗，75%酒精浸泡，高温灭菌，无菌操作过程和含抗生素的润滑液都保证了颗粒无微生物和内毒素污染，这对于体内和体外医学实验是非常重要的；(4)低能量缓慢摇晃和润滑液的加入，使磨块与罐壁、磨块与磨块之间进行缓慢的摩擦，产生细小的颗粒，筛选效率提高。
3. 2 颗粒的分离方法
本实验采用“梯度离心”的方法对颗粒进行筛选。其原理来自于Stokes' 法则：
R2=9ηh/(2t［ρ-ρ0］ω2n)
R：颗粒半径 η：润滑液黏滞度 h：样品高度 t：离心时间ρ：金属密度 ρ0：润滑液密度 ω：离心角速度 n：样品与旋转轴距离
本实验中的常规变量只有ω和t，因此公式简化为：
RCo2=4. 5×106/t(min)×ω2( r/min)
RTi2=9. 0×106/t(min)×ω2( r/min)
RCo：钴铬钼合金颗粒半径 RTi：钛合金颗粒半径 t：离心时间 ω：离心角速度
总之，本实验方法简单，设备要求不高，利于应用和推广。
3. 3 颗粒的粒度测定方法
传统的颗粒测定方法是在光镜或电镜下对颗粒进行直接计数，工作量大、精确度差。激光粒度仪利用测定激光束穿透颗粒混悬液的散射估计出颗粒的平均体积，如假设颗粒为标准球体，则可计算出颗粒直径。在应用中作者认为粒度仪用于人工关节颗粒分析的优势在于：测量速度快、误差小、可定量分析、操作简单，非常适合大量样本的检测与对比研究。激光粒度仪是确定颗粒大小的有效方法，但在应用中仍需注意：(1)激光粒度仪是在忽略颗粒形状差异的基础上对颗粒大小的计算和估计，所以颗粒形状对于结果有影响。光镜或电镜下对颗粒进行直接计数的方法可以弥补上述不足，并可以获得颗粒形态的直观资料，两者可以取长补短；(2)由于金属颗粒的密度大，在液体中沉降迅速，也给结果带来偏差。所以注意分离好的颗粒混悬液要尽快进行测定，测定前再次震荡混匀，有条件时可以选取甘油等高黏度悬浮液。
3. 4 发展方向展望
随着各种新型生物金属材料的不断产生和人们对金属-金属和陶瓷-陶瓷人工关节假体的重新评价，细小金属和陶瓷颗粒在假体松动中的作用又成为了研究的热点［2，3］。为适应这一研究发展的需要，作者正在研究能产生更加细小金属和陶瓷颗粒（直径25 nm左右）的方法。
图1 钛铝钒合金球磨罐和磨块 图2 钴铬钼合金球磨罐和磨块 图3 钛铝钒颗粒平均直径Dv90∶1. 009，99. 93%的颗粒直径在0. 3～1. 2 μm之间 图4 钴铬钼颗粒平均直径Dv90∶1. 008，99. 93%的颗粒直径在0. 3～1. 2 μm之间 图5 体外人工制造的钛铝钒合金颗粒扫描电镜显示：颗粒呈片状、盘状、柱状、针状等各种不规则形状，表面有低密度的血清蛋白沉积（2 000×） 图6 体外制备钴铬钼合金颗粒扫描电镜，铬钼合金颗粒更多为块状颗粒，是由于颗粒轻度聚集，显得体积更大（2 000×） 图7 体内分离与体外制备的钛铝钒颗粒扫描电镜比较 图7a R为体内分离颗粒 图7b 为体外制备颗粒。颗粒的形态均非常近似，表面都有血清蛋白的沉积膜，体内分离颗粒大小分布更加不均匀（R 1 000×，L 2 000×） 图8 作为空白对照组的J774A. 1巨噬细胞培养24 h后的形态，细胞成圆形或椭圆形，细胞轮廓清晰，胞浆内无明显吞噬小体（200×） 图9 J774A. 1巨噬细胞与钴铬钼颗粒共同培养24 h后的形态改变，细胞密度减小，细胞肿胀成圆形，胞核变大，甚至见到细胞大片坏死，核溶解，细胞碎裂，胞浆内有被吞噬的颗粒影像↑（200×） 图10 J774A. 1巨噬细胞内的金属颗粒，胞浆内线粒体和粗面内质网增生，颗粒进入细胞成为吞噬体，↑为金属颗粒。胞浆密度变得不均匀（3 500×）
【参考文献】
［1］ 贾庆卫, 孙俊英. 破骨细胞性骨溶解与关节假体无菌松动［J］. 江苏医药, 2002， 28(8): 619-620.
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［3］ Müller FA, Hagymási M, Greil P, et al. Transfer of metallic debris after dislocation of ceramic femoral heads in hip prostheses［J］.Arch Orthop Trauma Surg，2006，126(3):174-180.
［4］ Rogers SD, Pearcy MJ, Hay SJ, et al. A method for production and characterization of metal prosthesis wear particles［J］. J Orthop Res, 1993， 11 (6): 856-864.
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［6］ 贾庆卫，孙俊英, 江宏卫, 等. 碳增强的聚醚醚酮作为髋臼假体材料的实验研究［J］. 中国矫形外科杂志, 2003，11(3,4):210-213.
［7］ 贾庆卫，孙俊英, 孙 康，等. 碳增强的聚醚醚酮全髋假体复合材料的实验研究［J］. 中国矫形外科杂志, 2003，11(18):1279-1281.
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