骨髓基质干细胞修复软骨缺损的实验研究(1)

【摘要】  探寻体外诱导骨髓基质干细胞成软骨细胞的最佳细胞因子，寻求体内修复家兔软骨缺损的最为有效方案。［方法］rhFGF1、rhTGF-β1、rhIGF-I单独或联合应用对骨髓基质干细胞进行体外诱导培养，应用常规染色、MTT、免疫组织化学染色的方法筛选诱导骨髓基质干细胞成软骨细胞的最佳细胞因子，并将其与骨髓基质干细胞复合于纤维蛋白凝胶制成凝胶复合物，直接种植到兔膝关节实验性关节软骨缺损处，并与对照组相比较，观察软骨修复效果。［结果］常规形态学观察，rhTGF-β1和rhIGF-I联合应用诱导的细胞在形态上类似于软骨细胞，免疫组化染色提示诱导细胞具有软骨细胞表型。凝胶复合物直接种植在体内能诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞分化，修复缺损的软骨，缺少细胞因子的对照组软骨缺损修复效果差。［结论］rhTGF-β1和rhIGF-I联合应用可作为诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞分化的最佳组合，骨髓基质干细胞凝胶复合物能修复软骨缺损。

【关键词】  细胞因子 骨髓基质干细胞 软骨细胞 软骨缺损

    Abstract：［Objective］To retrieval a best cell factor which can induce bone marrow stromal cells (bMSCs) into chondrocyte in vitro and to explore an effective plan to repair rabbit's chondrocyte defect.［Method］Isolated bMSCs were cultured in vitro. rh Fibroblast Growth Factor 1(rhFGF-1)、rh Transforming Growth Factor-β1(rhTGF-β1)、rh Insulinlike Growth Factor-Ⅰ(rhTGF-Ⅰ) were utilizated. The proliferation of  cells was detected by MTT assay, and the macroscopic histology , HE staining and immunohistochemical examinations were performed  to seek the best cell factor. In vivo , to investigate the repair of the articular cartilage, bMSCs combined with fibrin glue and rhTGF-β1、rhIGF-I was compared with control group.［Result］The cells induced by rhTGF-β1 and rhIGF-I were similar to chondrocytes in morphology, and immunohistochemical examinations showed the cells possessed phenotype of chondrocytes. RhTGF-β1 and rhIGF-I could differentiate bone marrow stromal cells into cartilage cells in vivo, and repair the articular cartilage defect. The control group could not repair the articular cartilage defect efficiently.［Conclusion］rhTGF-β1 and rhIGF-I are best group which stimulate bMSCs to differenate into cartilage cells. BMSCs combined with fibrin glue and rhTGF-β1、rhIGF-I can repair the articular cartilage defect.

    Key words：cell factor;  bone marrow stromal cells;  chondrocyte;  cartilage defect

    作者简介：童培建(1961-)，男，杭州人，教授，主任医师，在读博士研究生，研究方向：关节外科，(电话)0571-87070956    骨髓基质干细胞（BMSCs）中含有少量的多功能基质干细胞，能向成骨系细胞、成软骨系细胞分化［1］，为骨、软骨组织的损伤提供了潜在的修复可能。临床软骨缺损自行修复的效果较差，可能跟软骨损伤局部BMSCs的含量少有关。因此作者通过对BMSCs在体外扩增培养、应用不同的细胞因子进行诱导，从中寻找体外促进骨髓基质干细胞增殖分化的最佳条件，并将细胞因子与骨髓基质干细胞复合于纤维蛋白凝胶制成凝胶复合物，植入缺损处，探讨体内修复家兔软骨缺损的效果。

    1  材料与方法

    1.1  骨髓基质干细胞的取材与培养

    取新生红皮胎兔２只（24 h内），置入浓度为75％的酒精中浸泡消毒5 min，在超净工作台中，无菌分离四肢长骨骨干，剔除软组织，在10％的DMEM培养液中剖开骨干，反复吹打髓腔。将细胞悬液移入离心管中，加入Hank's液至10 ml，平衡，1 500 r／min离心10 min，弃上清，加入10％ DMEM，反复抽吸吹打均匀，计数，按1×10７接种于２５ ml培养瓶中，37℃ 5％饱和湿度培养箱中常规培养。5 d后首次全量换液，以后每3 d换液1次，待细胞融合至80％时，0.25％胰蛋白酶常规消化，按１:３比例传代培养。逐日倒置显微镜观察培养细胞的生长情况。

    1.2  体外实验分组 

    实验分组如下：rhFGF-1组（简称F组）；rhIGF-Ⅰ组（简称I组）；rhTGF-β1组（简称T组）；rhFGF-1+ rhIGF-I组（简称F+I组）；rhFGF-1+ rhTGF-β1组（简称F+T组）；rhIGF-I+rhTGF-β1组（简称I+T组）；rhFGF-1+rhIGF-I+rhTGF-β1组（简称F+I+T组）；对照组（不加任何试剂）。其中rhFGF-1浓度为10 μg/L; rhIGF-I浓度为10 μg/L; rhTGF-β1 I浓度为5 μg/L。

    1.3  MTT比色法测定 

    取第2代骨髓基质干细胞以1×104/ml接种到96孔培养板上，共4块，常规培养24 h。待细胞完全贴壁后，弃上清液，将每块孔板随机分组，每组8孔，按实验分组添加相应的细胞因子，分别于第1、3、6、9 d各取孔板1块，进行MTT检测：即每孔加50 mg/ml的MTT液20 μl,常规培养4 h，弃废液，0.1%PBS液清洗1次，加入二甲亚砜，每孔150 μl，静置20 min后，用酶标仪测定波长为490 nm的吸光度值。

    1.4  体外细胞形态学观察

    将细胞进行HE、Ⅱ胶原免疫组化测定（ABC法），倒置显微镜下观察。

    1.5  纤维蛋白凝胶复合体的制备 

    传代培养的骨髓基质干细胞经0.1%胰蛋白酶＋0.02%EDTA消化后，1000 r/min离心10 min浓集，进行细胞计数。制成单细胞悬液，与纤维蛋白原溶液混匀。使纤维蛋白原和骨髓基质干细胞的终浓度分别为2.5 g/L和5×106/ml，每毫升再加入rhTGF-β 15 ng/5 μl和rhIGF-I50 ng/50 μl。然后加入凝血酶20 U/ml。制成凝胶备用（2 h内使用）。

    1.6  体内实验分组

    32只家兔，雌雄不限，随机分为4组。无菌条件下后肢右股骨髁滑车关节面钻孔，直径3.5 mm、深3.0 mm，达软骨下骨。干细胞复合体组：缺损中直接种植纤维蛋白凝胶复合体；单纯凝胶复合体组：缺损植入未加细胞因子的凝胶复合体；骨髓基质干细胞注射组：缺损单纯注射浓度为5×106/ml骨髓基质干细胞悬液0.5 ml；空白组：缺损不作处理。不固定术肢，自由活动。分别于4、8、12周处死取材。标本10％福尔马林固定。行HE、Masson三色、甲苯胺蓝染色检查。第12周标本行透射电镜检查。

    1.7  体内组织形态学评分 

    参照O'Driscoll，Keeley and Salter组织形态学评分标准。对实验组和对照组修复组织形态学进行半定量评分（表2）。

    1.8  统计学处理 

    实验数据用±s表示，显著性检验采用t检验。P＜0.05为差异有显著性。使用SPSS 11.5统计软件进行数据统计处理。

    2  结  果

    2.1  体外细胞形态学观察

    贴壁细胞呈梭形、纺锤形、多角形等，有不规则的生长突生出，细胞基质折光性强；4～5 d后细胞形成集落状，形态比较单一，基本上呈梭形或多角形；7～8 d后形成单层。

    首次传代的细胞呈圆形，24 h后恢复梭形，折光性好，细胞呈均匀生长，形态更加单一，基本呈梭形。8 d后可铺满瓶底，形成单层结构，排列呈有规律的方向性（图1）。经生长因子诱导的细胞，对照组、T组生长速度有所减慢，10 d左右形成单层结构；I+T组形态由梭形变为以扇贝形或多角形为主，细胞核深染（图2）；F组生长加快，在5 d形成单层，形态以长梭形为主（图3）。免疫组化染色显示：细胞基质呈棕黄色，染色较均匀，证明Ⅱ胶原存在［2］，部分细胞不着色(图4)。细胞经苏木素复染后可见细胞核深染，免疫组化染色后的细胞形态在镜下成圆形、椭圆形或多角形，不同于前2代的细胞形态(图5)。免疫组化染色（随机镜野）阳性率面积接近50%（图4、6）。图1  p1代 4×10  图2  HE（I+T组）10×40  图3  HE（F组）10×20  图4  免疫组化（I+T组）10×20  图5  免疫组化（I+T组）10×40  图6  免疫组化（I+T组）10×20

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