表1 受者动物给予不同处理后行同种皮片移植、皮片存活时间统计表
注：受者鼠在皮片移植前３０天给予900rad致死量伽玛射线照射，同时如表1所示，于照射后６h内回输不同的细胞。表中ｍｓｔ的 计算 基于３次不同的实验结果；*p＜0.005组１和组０间；p＜0.0001组１和组３间。mst，median survival time，即中数存活时间。dc，指经同种移植激活的树突状细胞，即balb/c小鼠先接受同种皮片移植（供者为c57鼠），10天后取脾细胞，经淋巴细胞分层液分层离心得到单核细胞，并用磁珠标记的抗小鼠pan-t抗体阴性分选去除ｔ细胞后得到的细胞。bmc，为同品系的balb/c小鼠骨髓细胞
2.3 激活的dc细胞诱导供者特异性移植耐受 为证实激活的dc细胞诱导的是供者特异性的耐受，我们取无关的供者129鼠的尾部皮片，如表1组3所示，与组1相比，受者的处理完全相同，但皮片来自无关的129鼠，该移植皮片在第10天均被完全排斥，mst=10天，与组1相比，差异有显著性（p＜0.001）。
相反，供者照射后仅给予骨髓细胞，产生的耐受是非特异性的，如组2、组4所示，受者对c57鼠和129鼠的皮片均产生耐受，两者mst均达到28天，差异无统计学意义（p＞0.05）。
2.4 移植皮片部位病理组织学 分析 如图3所示，第11天，组0(a)，组3（c）受者皮片完全被排斥，镜下观察见大量炎症细胞浸润，组0(a)皮片和受者移植部位相分离；相反，此时组1(b)皮片生长良好，镜下见移植皮片和受者移植部位没有脱离倾向，也未见明显炎症细胞浸润。
2.5 实验组的免疫学功能状态的流式细胞分析结果 分别于皮片移植术后第11、19、23天，取组0、组1移植受者外周血，用流式细胞分析外周血cd4+或者cd8+t细胞以及两者的比例。如表2所示，于第11天，组0和组1间，cd4+、cd8+细胞以及两者的比例差异有显著性；第11、19、23天，cd4+、cd8+细胞以及两者的比例在组1受者组内差异也有显著性（p＜0.01）。可见在免疫重建过程中，组1的cd4+辅助性t细胞于移植后30天，在比例和绝对数目上已经完全恢复；从cd4+/cd8+细胞比值看，骨髓移植后，比值明显升高了，一方面是cd4+的t细胞比例增加了，同时，cd8+t细胞比例减少了，cd8+的t细胞减少的幅度超过了cd4+的t细胞增加的幅度，结果cd4+/cd8+的比值，组1与组0相比，增加了3倍左右。在完全排斥的23天，其值达到最高峰（7.87）。
表2 流式细胞分析结果
注：于第11天，组0和组1间，cd4+、cd8+细胞以及两者的比例差异有显著性；第11、19、23天，cd4+、cd8+细胞以及两者的比例在组1受者组内差异也有显著性
3 讨论
皮肤移植是非常严格的移植排斥动物模型，皮肤是全身各种器官组织中最容易被排斥的组织，而且皮肤移植直观，操作相对简单［11］，所以我们选择它作为动物模型。在不使用系统性免疫抑制剂的情况下，我们在小鼠皮肤移植模型中成功诱导供者特异性免疫耐受，使皮片存活时间明显延长，对于c57bl/6来源的皮片，其mst达20天；相反，对于无关129鼠来源的皮片，其mst=10天。可能的耐受机制是复杂的：（1）可能是由于经同种移植激活的dcs携带供者特异性抗原，经尾静脉回输进入受鼠体内，然后随血液循环归巢到受者胸腺中，提呈供者抗原参与阴性选择过程，使受者在免疫重建过程中，大部分供者反应性的t淋巴细胞在胸腺水平经阴性选择由诱导凋亡克隆清除和克隆无能等机制去除掉，从而诱导对供者皮片的耐受，同时，在免疫重建的过程中，受者能保持对其他抗原的正常免疫应答；（2）也可能是供者抗原进入胸腺后，诱导调节性t细胞treg细胞对供者产生特异性的免疫耐受。（3）还可能是由于同种移植激活的dcs携带供者特异性抗原进入体内后，激活同种反应性t细胞回流入胸腺所致。
从组3的结果可知，接受了致死量照射的受鼠在经过30天的免疫重建后，于第10天就完全排斥了无关129鼠的皮片，一方面说明该耐受诱导方案的特异性；同时也表明，受鼠具备了完整的免疫功能，流式细胞分析的结果也进一步证实了受鼠的免疫功能，如表2所示，在免疫重建过程中，组1的cd4+辅助性t细胞于移植后30天，在比例和绝对数目上已经完全恢复；从cd4/cd8细胞比值看，由于外周cd4/cd8的比值是由胸腺的微环境决定的，胸腺的输出对于该比值有决定性的 影响 ，在正常的成年小鼠，其值介于2～4之间［12］；骨髓移植后，比值明显升高了。由于cd4+的细胞识别mhc class ii分子和外源性的抗原肽形成的复合体，因此推断可能是由于同种激活的dcs携带同种异型抗原分子进入胸腺后，一方面通过胸腺的阴性选择诱导细胞毒性的cd8+t细胞凋亡，因此外周cd8+t细胞的比例减少了近一半；同时，由于该方案诱导的是不完全的耐受，其mst=20天，移植术后不可避免的发生排斥反应，将导致了cd4+的t细胞数目增加，在完全排斥的23天，其值达到最高峰。
皮肤移植有高排斥性且操作简单，是良好的移植动物模型，但是在临床上多为自体皮肤移植，因此，我们也设想在今后的实验中尝试心脏移植、肾脏移植等其他的移植模型来进一步验证实验结果，期待能对将来的临床实体器官移植提供更有意义的 参考 ；对于激活的dc细胞呈递的供者抗原，我们也希望能在今后的实验中进一步提取、纯化，以期待分析诱导移植耐受的优势表位；同时，我们也在设计进一步的实验来验证前文所述的诱导该免疫耐受方案的可能机制。
(致谢：感谢北京大学人民 医院 肝病 研究 所的魏来教授，高燕教授提供指导和实验的部分场所；丛旭老师提供实验的技术支持)
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