摘要:目的 探讨慢性活动性乙型肝炎（CAHB）患者外周血活化抗原CD69、HLA-DR分子在T细胞表达的变化及其意义。 方法 以31例正常人作为对照，采用免疫荧光三色标记流式细胞术，检测30例CAHB患者外周血T细胞亚群及其CD69、HLA-DR抗原表达;同时用荧光定量PCR检测患者的病毒DNA载量。 结果 CAHB患者外周血CD3 + T细胞的百分率（63.78%±9.70%）与正常对照组比较差异有显著性（P<0.01），CD4 + T细胞的百分率（45.88%±8.51%）明显低于正常对照组（P<0.001），CD8 + T细胞的百分率（44.64%±7.10%）明显高于正常对照组（P<0.001）;CD3 + T细胞CD69的表达（6.85%±2.83%）与正常人对照组比较差异也有显著性（P<0.01），其中CD4 + T细胞CD69的表达（2.31%±0.94%）与正常对照组比较差异无显著（P>0.05），CD8 + T细胞表达CD69水平（3.87%±1.81%）明显高于对照组（P<0.01）;CD3 + T细胞上HLA-DR的表达（17.09%±4.23%）与正常对照组之间差异有显著性（P<0.001），其中CD4 + T细胞中HLA-DR + 细胞（7.97%±2.43%）和CD8 + T细胞中HLA-DR + 细胞（5.52%±1.48%）均比正常对照组显著增高（P<0.01）（P<0.001）;CD8 + CD69 + 、CD8 + HLA-DR + 细胞的数量与病毒DNA载量之间呈正相关。 结论 CAHB患者存在细胞免疫功能紊乱和淋巴细胞异常激活现象，T淋巴细胞的激活以CD8+T细胞为主，其在抗病毒感染中起着重要作用。
关键词:慢性;乙型肝炎;T淋巴细胞;CD69;HLA-DR
The expression of activated antigens in peripheral blood T lymphocyte subsets in patients with chronic active hepatitis B.
Abstract:Objective To investigate the expression of special marker for activation of peripheral blood T lymphocytes in patients with chronic hepatitis B virus and its significance. Methods Immunofluorescent three-color flow cytometry was used to study the expression of CD69and HLA-DR on T lymphocytes in30patients with chronic active hepatitis B virus and31normal controls.The viral load was determined by fluorescence quantitative PCR. Results Expression of CD3 + T cells were significantly lower in pa-tients（63.78%±9.70%）than that in controls（P<0.01），meanwhile the expression of CD4 + T cells was45.88%±8.51%，significantly lower than that of the controls（P<0.001）and the expression of CD8 + T cell was44.64%±7.10%，significantly higher than that of the controls（P<0.001）.Detection of CD69on CD3 + T cells in patients was6.85%±2.83%，significantly higherthan that of the controls（P<0.01）.NO significant difference in the expression of CD69on CD4 + T cells was observed be-tween patients and the controls（P>0.05），and the expression of CD69on CD8 + T cells was3.87%±1.81%，significantly dif-ferent from that of the controls（P<0.01）.The expression of HLA-DR on CD3 + T cells were significance difference between pa-tients（17.09%±4.23%）and that in controls（P<0.001）.The percentages of CD4 + T cells expressing HLA-DR in patients was7.97%±2.43%，significantly higher than that of the controls（P<0.01）.Significant difference was observed in the expression of HLA-DR on CD8 + T cells in patients（5.52%±1.48%）as compared with controls（P<0.001）.There were positive correlations between percentages of CD8 + CD69 + ，CD8 + HLA-DR+cells and viral load. Conclusion The findings support that cellular immunodeficiency exists in patients and that T lymphocytes were abnormally activated in the patients.The activation of peripheral blood T lymphocytes in patients mainly involves CD8+subset and it may play an important role in the immune response to antiviral infection.
Key words:Chronic，Hepatitis B;T-lymphocytes;CD69;HLA-DR
乙型肝炎病毒（HBV）是一种嗜肝DNA病毒，主要侵犯肝脏并在肝细胞内复制，但对肝细胞无明显杀伤作用，当机体针对HBV产生免疫反应时，才会引起肝脏病变。细胞免疫在乙型肝炎发生、发展过程中发挥着重要作用，机体细胞免疫状态的不同会导致不同的临床结果出现 ［1］ 。此外，Rehermann ［2］ 研究 发现HBV病毒感染可使机体免疫细胞异常激活和功能紊乱。T细胞是细胞免疫功能的主要执行者，包括CD4 + T细胞和CD8 + T细胞，目前国内外有关T细胞亚群活化抗原的研究在乙型肝炎发病中的报道较少。为了探讨T细胞及其亚群的激活在CAHB发病机制中的作用，现采用免疫荧光三色标记流式细胞术检测30例CAHB患者外周血早期活化抗原CD69和晚期活化抗原HLA-DR在T细胞上表达的变化，并分析其意义。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 研究对象 依据2000年中华医学会传染病与寄生虫病学会、肝病学分会联合修订的病毒性肝炎的诊断标准 ［3］ 确诊的30例患者，其中男23例，女7例，平均年龄34.8岁（20～58岁），所有患者的HBV血清标志物（HBsAg、HbeAg、抗HBc）均呈阳性，血清HBV DNA定量>1×10 8 拷贝/L，丙氨酸转移酶（ALT）异常>正常3倍以上，检测前1月未使用过糖皮质激素类药物或其他影响免疫功能的药物治疗;正常人31例，其中男21例，女10例;平均年龄33.6岁（19～56岁），均排除有慢性传染性疾病或感染性疾病，HBsAg阴性及丙氨酸转移酶正常。
1.1.2 试剂及仪器 三色荧光标记单克隆抗体CD8FITC/CD69PE/CD3PerCP，CD4FITC/CD69PE/CD3PerCP和阴性同型对照γ 1 FITC/γ 1 PE/CD3PerCP以及CD3PerCP，红细胞裂解液为BD FACS TM Lysing solution以上产品均购自美国Becton Dickinson公司，HLA-DR-FITC、CD4-PCY5、CD8-PCY5单抗和同型对照IgG2b为法国Immunotech公司产品。FACSCalibur流式细胞仪为美国BD公司生产。HBV核酸扩增荧光定量PCR试剂盒为深圳匹基生物工程股份有限公司产品，PCR仪为Roche公司的light cycler荧光定量核酸检测仪。
1.2 方法
1.2.1 标本收集 取患者及正常人静脉血5ml，分两管，一管用肝素抗凝，用于流式细胞检测，另一管不加抗凝剂，分离血清后用于肝功能和HBV-DNA病毒载量测定。
1.2.2 流式细胞术检测外周血T淋巴细胞及其活化抗原 肝素抗凝血分装6管，每管加100μl全血，再分别加入10μl上述三种三色荧光标记单抗试剂以及CD4-PCY5、CD8-PCY5、CD3PerCP和HLA-DR FITC单抗及同型对照IgG2b，4℃避光孵育20min，加红细胞溶解液2ml混匀，室温放置5min，离心弃上清，用PBS洗涤2次，将细胞重悬于1%多聚甲醛固定液500μl中，用FACSCalibur流式细胞仪CellQuest软件获取收集30000个细胞/管，用前向散射角（FCS）及侧向散射角（SSC）确定淋巴细胞群再以PerCP标记CD3 + 的细胞射门并分析数据，以荧光抗体染色阳性细胞占CD3 + T细胞的百分率记录结果。
1.2.3 病毒DNA载量检测 采用荧光实时定量PCR法，严格按操作说明书要求进行检测，将结果换算成对数值备用。
1.3 统计学分析 所有资料采用SPSS11.0统计软件进行分析，各组间比较取均数及标准差（x±s）进行t检验，各参数与病毒载量的相关性用Spearman相关分析。
2 结果
2.1 CAHB患者外周血T细胞亚群的分析 患者外周血CD3 + T细胞水平与正常对照组相比明显降低（P<0.01）;患者外周血CD3 + CD4 + T细胞水平显著低于正常对照组（P<0.001）;患者外周血CD3 + CD8 + T细胞水平显著高于正常对照组（P<0.001）。CD4 + T、CD8 + T的百分率与病毒DNA载量之间无相关性。结果见表1。
表1 CAHB患者外周血T淋巴细胞亚群的检测（略）
Tab1 Expression of T lymphocyte subsets on peripheral blood in patients
注:与对照组相比，※P<0.01;※※P<0.001。
Note:Compared with normal control group，※P<0.01;※※P<0.001。
乙醇对小鼠原代肝细胞脂肪酸氧化速度的影响
肝病患者血脂、胆碱酯酶检测的临床价值