高效液相色谱法测定人血浆中二甲双胍的含量(1)

    【关键词】  二甲双胍；高效液相色谱法

    二甲双胍（metformin）是双胍类口服降糖药，它主要作用于胰岛外组织，抑制肠吸收葡萄糖，增加外周组织对葡萄糖的利用，减少肝糖原异生，达到降血糖的目的，适合2型糖尿病患者。文献报道常用的检测方法是高效液相色谱法［1～3］，常用内标为阿替洛尔［1，3］。流动相常加入的离子对试剂，如十二烷基硫酸钠［1］、庚烷磺酸钠［2］和辛烷磺酸钠［４］。本文建立一种在流动相中加入十二烷基硫酸钠，采用高氯酸直接沉淀，测定其浓度的一种简易方法。

    1  实验材料

    1.1  试验药品及试剂  二甲双胍标准品：中国药品生物制品检定所提供。乙腈（色谱纯）：Fisher Company,Inc,USA;其余试剂均为市售分析纯。

    1.2  仪器  Shimadzu高效液相色谱仪：CBM-10A系统控制器；LC-10ATvp泵；DGU-12A除气机；CTO-10Avp柱温箱；SPD-12AV紫外检测器；Milli-Q Gradient A10超纯水器（Millipore Inc,USA)。

    2  血浆中二甲双胍的HPLC法测定

    2.1  色谱条件  流动相由水相（4mmol/L十二烷基硫酸钠，0.02mol/L NaH2PO4，0.5%三乙胺，用H3PO4调pH为4.0）-乙腈（74：26，v/v）组成，流速1.0ml/min；色谱柱为Discovery ODS 5.0μm 4.6×250mm I.D.;柱温箱温度４０℃。

    2.2    血浆样品的提取与分离  取血浆0.5ml，加入0.1ml 30%高氯酸，振荡1min，离心（18000r/m×10min),取20μl进样，用样品的峰面积进行定量分析。

    2.3  方法的专属性  在本试验条件下，盐酸二甲双胍有较大的色谱峰和较好的分离度，血浆中杂质不干扰样品峰，基线噪音小（Ｓ／Ｎ＞3），盐酸二甲双胍的保留时间约为8.08min（见图1）。

    2.4  血浆中二甲双胍标准工作曲线制备及其最低检测浓度测定  取空白血浆0.5ml，加不同量的标准品，使其浓度分别为0.0125、0.025、0.05、0.125、0.25、0.625、1.25和2.50μg/ml，按“血浆样品的提取与分离”项下操作，记录样品峰面积，利用样品浓度C对样品峰面积作直线回归，得回归方程A=54.608+47164 C，r=0.9999，（P<0.01,n=5）(见图2),线性范围0.0125～2.50μg/ml,最低检测浓度0.0125μg/ml。

     2.5  回收率测定  取离心管数支，精密加入0.5ml超纯水，分别取盐酸二甲双胍标准液适量，配成含盐酸二甲双胍浓度分别为0.025、0.125和1.25μg/ml的溶液，按“血浆样品的提取与分离”项下操作，计峰面积As。另取离心管数支，加入0.5ml空白血浆，精密加入盐酸二甲双胍适量，配成0.025、0.125和1.25μg/ml的血浆，每种浓度各做5份样品。按“血浆样品的提取与分离”项下操作，计峰面积Ai，计算Ai与As的比值。结果高、中、低浓度的回收率分别为：93.9%，92.6%及91.4%。

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