作者：胡权,张正茂,张小勇,张振华,雷延昌,周敦金,黄建国,杨东亮
【摘要】 目的 构建鸭乙型肝炎病毒（DHBV）感染性克隆，通过体外细胞转染获得单一来源、基因序列清楚的体内实验的感染毒种。方法 以湖北麻鸭DHBV分离株（DQ276978）为模板，用PCR法从该DHBV全基因组克隆质粒（pMD-DHBV）和DHBV阳性血清中获取3部分基因片段，总长44kb，克隆至载体PCR21的SacI和NotI酶切位点，构建含15倍鸭乙型肝炎病毒全基因的重组质粒，并酶切鉴定其插入方向。将构建的重组质粒经脂质体LipofectineTM 2000导入鸡肝癌细胞系(LMH)细胞中转染表达，收集纯化后的转染细胞培养上清液作为体内实验感染的标准毒种。结果 PCR鉴定、酶切鉴定及序列测定，证实成功获得正向插入的1.5倍鸭乙型肝炎病毒全基因重组质粒PCR2.1-DHBV1.5。Southernblot检测表明，该重组质粒在LMH细胞内存在各种病毒复制中间体；通过电镜观察，转染细胞上清液中存在DHBV完整病毒颗粒。结论 经体外重组，构建出携带1.5倍加长DHBV基因组片段的重组质粒PCR21-DHBV15，并可在鸡肝癌细胞LMH中介导高水平病毒复制，从而获得含可自我复制病毒颗粒的转染细胞上清液作为动物体内感染接种物。
【关键词】 鸭乙型肝炎病毒
鸭乙型肝炎病毒（DHBV）与人类乙型肝炎病毒（HBV）同属嗜肝DNA病毒科，它们在形态结构、基因序列、病毒复制、致病机制及感染宿主规律等方面均较为相似，DHBV感染鸭模型使人们认识了嗜肝病毒的复制周期以及病毒持续存在和病毒彻底清除的机制。我们在对湖北麻鸭DHBV自然感染率调查的基础上，选择对DHBV易感且取材方便的湖北麻鸭作为实验鸭种，并分离出1株DHBV新毒株（DQ276978）〔1〕。进而以该毒株为模板，构建了15倍DHBV全基因重组质粒，通过该质粒在鸡肝癌细胞系(LMH)中稳定转染表达出含有可自我复制的病毒颗粒的细胞培养上清液作为单一来源、基因序列清楚的实验毒种，以期建立标准化的湖北麻鸭乙型肝炎病毒体内模型。另外，将该DHBV重组质粒与不同剂量人类载脂蛋白BmRNA编辑酶催化多肽3G(APOBEC3G)真核表达质粒共转染LMH细胞，通过抑制实验以证实该DHBV体外实验模型的初步应用。
1 材料与方法
11 材料
111 质粒 pMD-DHBV为本实验室构建的含有湖北麻鸭（DQ276978）DHBV DNA全长基因组的质粒；pSP65-DHBV16为双拷贝头尾相接的全基因DHBV DNA重组质粒，该克隆质粒(美国 Mandart 教授馈赠)；APOBEC3G真核表达质粒为本实验室构建保存；PCR21载体(美国Invitrogen公司)。
112 DHBV阳性血清 取自扩增出DHBV DNA全长基因组（DQ276978）的阳性血清。
113 细胞 禽类鸡肝癌细胞系LMH，为本室传代保存。
114 工具酶 LA Taq酶、限制性内切酶EcoR I、BamH I、Sac I、Kpn I、Not I及凝胶回收试剂盒(大连 TAKARA公司)；Taq DNA聚合酶(美国Promega公司)；T4DNA连接酶(美国GIBICO公司)。
115 生化及其它试剂 地高辛(DIG)标记及检测试剂盒(德国Roche公司)；Waymouth 细胞培养基(美国Sigma公司)；LipofectineTM2000(美国Invitrogen公司)。DNA凝胶回收试剂盒、PCR产物回收试剂盒(德国QIAGEN公司)；质粒提取试剂盒和动物培养细胞基因组DNA纯化试剂盒(大连TaKR公司)。
12 方法 通过对湖北麻鸭（DQ276978）DHBV DNA的全长克隆质粒的序列限制酶切图谱分析〔1〕，已明确其基因组的结构及与复制相关的重要元件的序列位置，在此基础上运用3片法构建出能自我复制的重组质粒。
121 构建质粒PCR 21-DHBV15 用EcoRI和BamHI双酶切pMD-DHBV，得到目的片段DA（DHBV3024/0nt-1473nt）；设计引物DB1/DB2和DC1/DC2分别经PCR扩增DHBV阳性血清获得目的片段DB（1473nt-2870nt）和DC（1395-3024/0nt）。将上述3片段插入PCR21的相应酶切位点后即得到15倍DHBV全基因重组质粒PCR21-DHBV15。
122 PCR鉴定 引物Ps1/Ps2和Pc1/Pc2为DHBV基因S区和C区的高度保守序列段，引物序列如下：Ps1（1318F）5′-TGGCCTAATCGGATTACTGG-3′，Ps2（1739R）5′-CAGCGTGGCTAATTGAGTTA-3′；Pc1（187F）5′-GCAATCACTAGACCAATCCA-3′，Pc2（397R）5′-GAGATCTATGGTGGCTGCTC-3′。PCR反应液组成：10×Buffer5μl;MgCl2（25mmol/L）3μl;dNTP（10mmol/L）1μl;Ps1/Ps2或Pc1/Pc2各1μl；Taq酶1μl；DHBV模板5μl；加灭菌纯水至50μl。PCR循环参数：94℃5min；94℃50s,61℃45s,72℃50s,40个循环；72℃10min。
123 酶切鉴定 用BamHI，SacI和EcoR I，Not I和EcoRI，Sac I和BamH I分别进行酶切鉴定。
124 序列测定 取一株阳性克隆质粒送上海生物工程技术服务公司测序。
125 脂质体LipofectineTM2000介导的DNA转染 在LMH细胞达到80%～90%融合时进行转染，设未转染LMH细胞对照和pSP65-DHBV16质粒对照。
126 蛋白印迹(Southern Blot)分析 提取转染LMH细胞内总DNA后，用DIG标记的DHBV全长基因组探针杂交，X-ray胶片发光显影。
127 转染细胞上清液中病毒颗粒电镜观察 收集转染细胞的上清液，离心后用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解沉淀，将该沉淀溶解物通过磷钨酸负染法进行电镜观察。
128 APOBEC3G真核表达质粒对DHBV的抑制效应实验 质粒PCR21-DHBV15分别与不同剂量（20和40μg）的APOBEC3G真核表达质粒pXF3G-HA通过LipofectamineTM2000共同转染LMH细胞，72h后收集细胞。
2 结果
21 重组质粒PCR21-DHBV15的PCR鉴定 重组质粒PCR21-DHBV15经不同引物C1/C2、S1/S2、DB1/DB2和DC1/DC2扩增后可产生依次为211，452，1 430和1 600的目的片段（图1）。
22 重组质粒PCR21-DHBV15的酶切鉴定 未酶切的重组质粒PCR21-DHBV15为84kb；用SacI和EcoRI双酶切该重组质粒可产生29和55kb的片段；该重组质粒经BamHI限制性内切酶消化后产生31和53kb的目的片段；用NotI和EcoRI双酶切PCR21-DHBV15可产生16和68kb的片段；用SacI和BamHI限制性内切酶消化该重组质粒后则产生16和68kb的目的片段。上述酶切结果均与预期相符（图2）。
23 转染细胞上清液中DHBV病毒颗粒的检测 在转染细胞上清液中检出大量直径为30～65nm的球形颗粒，其中一种为大小较均一，直径为40～50nm的实心病毒，有核心和球形包膜，即完整病毒颗粒；另一种是直径为30～65nm的类球形空心病毒，中央凹陷，未见丝状、管状体，即病毒表面抗原颗粒（图3）。
24 转染细胞内DHBV DNA的检测 分别将pSP65-DHBV16和PCR21-DHBV15转染LMH细胞，72h后收集细胞，提取DNA进行Southernblot检测。结果显示，重组质粒PCR21-DHBV15与双拷贝DHBV全长基因组质粒pSP65-DHBV16一样，均在转染细胞中检出大量DHBV DNA复制中间体（图4）。
M：DL2000 Marker;1：primer C1/C2;2：primer S1/S2;3：primer DB1/DB2；4：primer DC1/DC2
图1 重组质粒PCR21-DHBV15的PCR鉴定（略）
M1：1Kb Marker;1：PCR2.1-DHBV1.5；2：PCR2.1-DHBV1.5/SarI+EcoR I;3：PCR2.1-DHBV1.5/BamH I;4：PCR2.1-DHBV1.5/Not I+EcoR I;5：PCR2.1-DHBV1.5V/Sac I+BamH I;M2：500bp Lad der
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