作者：吕晓云，蒲晓丽，陈静，朱玉真，赵健雄，魏虎来
【摘要】 目的 研究灌服中药扶正解毒汤(FJD)后兔血清对硫酸镍(NiSO4)暴露的人支气管上皮细胞(16HBE)自由基含量及8羟基2脱氧鸟苷三磷酸酶(8oxodGTPase)表达的影响。方法 体外培养的16HBE细胞分别经NiSO4暴露及NiSO4加扶正解毒汤含药血清共同处理后，采用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)及实时荧光定量RTPCR检测自由基含量及8oxodGTPase表达的变化。结果 NiSO4(800μmol/L)暴露的16HBE细胞，其自由基含量及8oxodGTPase表达水平均高于NiSO4与扶正解毒汤(10%)共处理组细胞，Ｐ＜005～001，相对标准偏差(RSD)＞2%。结论 8oxodGTPase可作为镍暴露氧化应激的标记物；中药扶正解毒汤通过清除自由基，下调8oxodGTPase的表达，对镍暴露氧化损伤具有显著的抑制作用。
【关键词】 扶正解毒汤
本课题组多年进行的体内实验及职业病临床研究表明，中药扶正解毒汤(FJD)具有良好地拮抗镍毒性的作用〔1，2〕。本文从体外途径研究了中药解毒汤对硫酸镍(NiSO4)暴露的人支气管上皮(16HBE)细胞内自由基含量及8羟基2脱氧鸟苷三磷酸酶(8oxodGTPase)表达的影响，旨在为该复方的作用机制补充新的资料。
1 材料与方法
11 材料
111 细胞及动物16HBE细胞(美国ATCC公司)。纯种青紫兰兔8只，雄性，体重(21±03)kg(中国兰州生物制品研究所)，合格证号：14004，常规饲养。
112 中药 扶正解毒汤由红芪、当归、丹参、枸杞等组成，以三蒸水煎煮，过滤、浓缩成含生药4g/ml的溶液，高温高压消毒灭菌，密封，4℃以下储存备用。
113 主要试剂及设备 基础培养液(MEM)培养基、Trizol试剂盒(美国GIBCO公司)；小牛血清(杭州四季青生物工程材料公司)；乙酰乙酸盐2，7二氯氢化荧光素(D399)(美国Molecular Probes公司)；ExScripＴＭRT reagent Kit及SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒(日本TaKaRa公司)；TCS sp2型激光扫描共聚焦显微镜系统(德国Leica公司)；Smart Cycler ⅡSystem荧光定量PCR仪(美国PE公司)。人类human NutT homologue (hMTH1)基因PCR引物设计参照文献〔３〕。分别为P1：5′CTTCTCTGCGCCACTCAA3′，P2：5′GAGCGGCGGTGCAGAACC3′；预计扩增片段177bp。βactin引物为P1：5′TTGCGCTCAGGAGCAAT3′，P2：5′TTCCAGCCTTCCTTCCTGG3′；预计扩增片段223bp(宝生物工程有限公司合成)。
12 方法
121 扶正解毒汤血清冻干粉制备 以中药扶正解毒汤12g/kg每天分2次给兔等体积灌胃，空白对照组予以生理盐水(灌胃前均禁食，自由取水)，共3d。于末次灌胃后2h心脏采血，按文献〔4〕方法制备扶正解毒汤血清及空白血清冻干粉。
122 细胞培养及受试物处理 16HBE细胞用含10%小牛血清、青霉素及链霉素的MEM培养基于37℃，5%CO２饱和湿度的环境中培养。试验时以不含小牛血清的MEM培养液将细胞调至1×104/ml，按以下分组分别处理：(1)NiSO4组：NiSO4以无血清MEM培养液溶解，终浓度800μmol/L(预试验中，NiSO4≥800μmol/L时，细胞存活率骤降至60%以下，故以800μmol/L作为此试验浓度)。(2)扶正解毒汤+NiSO4Ⅰ组：NiSO4染毒前4h加入扶正解毒汤血清，终浓度为10%(体积分数)，再加入NiSO4(800μmol/L)。(3)扶正解毒汤+NiSO4Ⅱ组：同时加入扶正解毒汤与NiSO4。(4)空白血清对照(简称空白血清)+NiSO4组：同时加入空白血清与NiSO4。终浓度均同(2)。(5)空白血清组：加入空白血清(10%)。(6)阴性对照组：MEM培养液。
123 细胞存活率检测 以常规台盼蓝计数法检测各组细胞存活率，每组共计数250个细胞。
124 细胞内自由基含量检测 在加入NiSO416h后，将收集的各组细胞制成细胞悬液，取D399(5μg/ml)1ml，加至各细胞悬液中，按文献〔5〕方法以激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)检测16HBE细胞内自由基含量(以平均荧光强度表示)。
125 RNA提取、cDNA合成及标准定量模板的制备 在进行自由基含量测定的同时，另收集各组细胞，按Trizol试剂盒说明，提取各组总RNA，测定A260，A280的吸光度值，计算出RNA的含量，并按ExScriptTMRT reagent Kit操作说明逆转录合成cDNA,置于-80℃保存备用。将宝生物工程有限公司构建的hMTH1及βactin定量PCR标准品质粒利用各自的引物进行RT-PCR扩增，制备6个不同浓度的标准模板，分别定义为101～106拷贝数/μl，-20℃保存备用。
126 SYBR GreenⅠ实时定量PCR反应 根据SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒说明，设定反应扩增条件，将6组实验样品与不同浓度的标准模板同时进行PCR。重复3次。将检测的临界点设定在扩增过程中，荧光信号由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环数(threshold cycle,CT)作为模板初始浓度的间接指标，将不同浓度的标准模板拷贝的对数相应的CT值作图，得到标准曲线。
127 8oxodGTPase(hMTH1 mRNA)表达的相对定量分析 将得到的各组hMTH1基因及βactin基因的值分别代入各自的标准曲线，换算出各自的起始模板量。以βactin作为参比基因对所有样品进行RNA校正，用hMTH1基因的定量结果除以βactin定量结果即可得到校正值。以阴性对照组hMTH1 mRNA的表达量作为“1”，再根据校正值计算出其他各组的相对量，进行组间相对量的比较。
13 统计分析 采用SPSS 100统计软件进行分析；组间差异用t检验及相对标准偏差(RSD)检验(以RSD＞2%为差异有统计学意义)。
2 结果
21 细胞存活率 经台盼蓝计数，各组的细胞存活数均不低于90%，且差异无统计学意义。
22 LSCM检测结果(表1，图1A～Ｃ) NiSO4染毒后16h，细胞D399平均荧光强度(自由基含量)明显增强，扶正解毒汤血清与NiSO4共处理各组D399平均荧光强度显著低于NiSO4组(Ｐ＜005～001)；空白血清对染镍细胞内自由基含量变化无影响。
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