邻苯二甲酸二丁酯雄性生殖毒性分子作用机制(1)-找论文网

作者：敖红，林玲，阚海东，陈秉衡，张蕴晖

【摘要】 目的研究邻苯二甲酸酯类对大鼠睾丸毒性作用的分子机制。方法运用RT-PCR方法观察邻苯二甲酸二丁酯(DBP)对大鼠子代不同发育阶段睾丸的苗勒氏管抑制物质(MIS)、雄激素结合蛋白(ABP)和抑制素(inhibin)表达水平的影响，并采用ELISA法检测DBP染毒后大鼠睾酮水平的变化情况。结果与对照组比较，各DBP染毒组大鼠睾丸中MIS表达差异无统计学意义，血清总睾酮水平差异无统计学意义，但高剂量DBP(1000mg/kg)组睾丸支持细胞中ABP和抑制素(inhibin)的mRNA表达量显著减少，且与睾丸损害呈时间-效应关系。结论环境内分泌干扰物DBP可干扰大鼠发育过程中睾丸支持细胞ABP和inhibin的表达，其对性腺发育的影响可能是DBP雄性生殖毒性的主要作用机制之一。

【关键词】 邻苯二甲酸酯类

　　近年来，塑料增塑剂邻苯二甲酸二丁酯(DBP)被认为是一种环境内分泌干扰物，主要表现为雄性生殖发育毒性(染毒大鼠睾丸萎缩、附睾发育不良、尿道下裂等)〔1，2〕。本研究以DBP为邻苯二甲酸酯类(phthalates)的代表物，观察DBP对发育过程中F1代幼鼠睾酮(T)水平和雄激素结合蛋白(Androgen-binding protein,ABP)、抑制素(inhibin)、苗勒氏管抑制物质(MIS)基因表达影响，从调控雄性生殖系统的下丘脑-垂体-性腺轴角度探讨其生殖发育毒性的作用机制。

　　1 材料与方法

　　11 试剂 DBP(分析纯，纯度≥995%，上海溶剂厂)；吐温-80(化学纯，符合Q/CYDZ-162-97，中国医药集团上海化学试剂公司)；市售精制大豆油；大鼠睾酮酶联免疫试剂盒(美国Biotech公司)；单克隆兔抗带状闭合蛋白1(zona cocludens1)，ZO1)抗体(美国Zymed Laboratories公司)和四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC山羊抗兔IgG)(北京中山生物医学有限公司)。

　　12 剂量设置及试剂配制共设3个染毒组，DBP染毒剂量依次为50，200，1000mg/kg。另设1个溶剂对照组(0mg/kg)。准确称取100g DBP置入干净的烧杯中，按1∶2比例加入吐温80和精制植物油，定容至500ml，为高剂量组；依次配制中剂量和低剂量组，溶剂对照组用1∶2的吐温80和植物油加蒸馏水配制而成，其中吐温80和植物油的用量同高剂量组。

　　13 动物来源及染毒方法

　　131 实验动物 SPF级Sprague-Dawley大鼠(上海西普尔-必凯实验动物有限公司)，沪动合格证字152号，NO.02-4-20，雌性100只，体重(200±20)g，雄性50只，体重(300±30)g。

　　132 饲养条件清洁级动物房，温度为(22±3)℃，相对湿度为50%～60%，人工照明，12h光照，12h黑暗。动物食用标准颗粒饲料，自由饮水。

　　133 染毒方式孕鼠灌胃染毒，自妊娠第1d(gestation day 1,GD1)至哺乳期结束〔出生后21d(postnatal day 21,PND21)〕，每天1次，灌胃容积为05ml/(100g·bw)。停止染毒后，F1代雄鼠饲养至性成熟期PND70d。

　　134 实验设计清洁级SD成年大鼠，适应性饲养1周后，按1∶2比例将雄、雌性大鼠合笼，合笼后每天清晨固定时间做阴道涂片，显微镜下查涂片上有无精子以确定是否受孕。查到精子后，将受孕大鼠取出，按体重随机分配至4个实验组，查到精子的当天确定为妊娠第0d(GD0)。2周交配试验结束后，弃去雄鼠和未怀孕的雌性大鼠，每个实验组由20只怀孕母鼠组成，自受孕第2d(GD1)开始，灌胃染毒至哺乳期结束(PND21)；每天称重一次，并根据体重调节染毒容积；出生后4d(PND4)按照欧洲经济合作与发展组织(OECD)实验指南(No.414)要求〔3〕，为保持仔鼠营养的均衡性，进行窝标准化操作，即保持每窝8只仔鼠(4只雌鼠，4只雄鼠)，不足8只的窝剔除，这样对照组、低剂量组和中剂量组各有16窝，高剂量组有14窝。F1代雄性仔鼠出生第1，4和21d，每组选取5只动物，无菌环境中，迅速取下睾丸组织，立即置于放在干冰上的无酶离心管中，-70℃保存至RNA抽提。

　　14 血清睾酮水平的测定采用ELISA方法测定PND70d大鼠的血清睾酮水平，睾酮酶联免疫试剂盒(美国Biotech公司)，按试剂盒说明进行操作。

　　15 RNA的提取用TRIzol试剂一步法提取睾丸组织总RNA。
　　
　　16 RTPCR引物根据Genebank中SD大鼠的RNA序列，用Primer5引物设计软件自行设计ABP、Inhibinα和MIS的引物序列。βactin(470bp):Sequence 5′CGGATGTCCACGTCA CACTT3,antisequence 5′GTTGCTATCCAGGCTGTGCT3′;ABP(286bp):Sequence 5′ATCAACTGCTTGGGGTTCAC3′,antisequence 5′GAGCCTGGTCAGAGGCATAG3′;Inhibinα(208bp):Sequence 5′GCTCTACCAGGGAGCATGAG3′,antisequence 5′CACCTTCCTCCTAGCTGACG3′;MIS(307bp):Sequence 5′AGCAAGGCTTCCCTGACGGT3′,antisquence 5′CAGGGTATA　GCACTAACAGG3′;GAPDH(153bp):Sequence 5′GTGCTGAGTATGTCGTGGAG3′,antisequence 5′TGTCATATTTCTCGTG
GTTC-3′。

　　17 RTPCR程序向RTPCR反应液中加入1μl的引物及3μl的模板，混匀后放入PCR仪中反应。PCR扩增条件：50℃逆转录30min；94℃预变性2min；94℃ 30s，55～64℃ 30s［βactin和ABP的退火温度为56℃，inhibin、MIS和内标磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde3Phosphate Dehydrogenase,GAPDH)的退火温度为58℃］，72℃ 60s,30～35次循环；72℃延伸10min。取5μl水浴产物与1μl加样缓冲液混匀，加至凝胶的加样孔中，电泳。电泳15～30min后在紫外灯下观察结电泳结果，在凝胶成像系统下成像扫描目标DNA片段的灰度，进行半定量分析。

　　18 统计方法采用SPSS110软件，进行方差分析。

　　2 结果

　　21 PND1d F1代大鼠睾丸MIS表达(图1、表1) 结果可见，片断长度为304bps的性别分化相关基因MIS在对照组和各DBP染毒组大鼠睾丸中表达差异无统计学意义。

　　22 PND70d F1代大鼠血清睾酮水平 DBP宫内暴露和哺乳期染毒，F1代仔鼠生长至性成熟期后，取血清测定睾酮含量，以观察DBP对仔鼠睾酮水平的影响。结果表明随着染毒剂量的增大，F1代大鼠血清睾酮水平逐渐降低，但经统计学分析，各组间睾酮水平的差异无统计学意义(P>005)。

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