作者：柳艳，李磊，刘王莹，陈茂勇，吴倩
【关键词】 丹酚酸；抗氧化；DNA损伤；化学发光
摘要： 目的 探讨丹酚酸抗氧化活性及其对DNA氧化损伤的保护作用机制。方法 运用自由基反应模型观察丹酚酸对二苯代苦味酰肼自由基(DPPH)和羟自由基的淬灭效应，使用邻菲罗啉(Phen)-CuSO4-VC-H2O2-DNA化学发光体系测定丹酚酸对DNA损伤的抑制作用。高效液相色谱(HPLC）测定丹酚酸的组成。结果 丹酚酸水提物(AE)、乙酸乙酯萃取物(EE)、大孔吸附树脂纯化物（RE)和对照维生素(VC)、二丁基羟基甲苯(BHT)对DPPH自由基的半数清除浓度(IC50)分别为1412，153，146，158和715μg/ml。化学发光体系中，丹酚酸的加入能明显抑制并延迟DNA损伤。AE、EE、RE抑制发光50％浓度(IC50)值分别为12936，620，492μg/ml。丹酚酸清除DPPH自由基能力和对羟自由基攻击的DNA损伤保护作用受丹酚酸组成和丹酚酸B含量的影响。结论 丹酚酸属于预防型和断链型抗氧化剂，并可有效清除DPPH和羟自由基，对DNA损伤有明显保护作用。丹酚酸的抗氧化活性及对DNA损伤的保护作用与丹酚酸B含量有关。
关键词： 丹酚酸；抗氧化；DNA损伤；化学发光
Antioxidant activiy and protection effect of salvianolic acids on DNA damage
Abstract： Objective To study on the antioxidant activity of salvianolic acids and mechanisms of its protection against DNA antioxidative damage.Methods Free radical model was employed to investigate the scavenging activity to 1，1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl(DPPH) and hydroxyl free radicals.The mechanisms of the effects of salvianolic acids on protection against DNA damage was measured by chemiluminescence on the reaction system of phenanthroline (Phen)-CuSO4-VC-H2O2-DNA.Salvianolic acids composition in samples were determined according to HPLC analysis.Results The hemi-inhibitable concentration(IC50) of crude aqueous extract(AE)，ethylacetate extract(EE)，resin extract(RE)，ascorbate(VC) and butylated hydroxytoluene(BHT) to DPPH free radicals were 141.2，15.3，14.6，15.8 and 71.5μg/ml.Three extracts could obviously inhibit and delay DNA damage caused by hydroxyl free radicals.The IC50 valvue of chemiluminescence of AE，EE and RE were 1293.6，62.0，and 49.2μg/ml.The scavenging activity and protective effects against DNA damage were effected by salvianolic acids composition and salvianolic acid B level.Conclusion Salvianic acids can effectively scavenge DPPH and hydroxvl free radicals，protect against DNA damage which belongs to preventive and chain-breaking antioxidants，and the effects are related to salvianolic acid B level.
Key words： salvianolic acid；antioxidant；DNA damage；chemiluminescence
丹参是我国防治心脑血管病的传统药物，对冠心病、高血压、糖尿病肾病及癌症等疗效确切。近20多年来的药效研究表明，丹酚酸是丹参活血化瘀作用的主要功能成分〔1〕。自由基参与机体多种疾病的发生和发展过程，清除自由基、提高机体抗氧化能力，是许多药物防治慢性疾病的重要途径〔2，3〕。从化学结构上分析，丹酚酸类化合物是酚羟基的供体，具有抗氧化活性的结构基础。本文研究了丹酚酸对二苯代苦味酰肼自由基(DPPH）的清除效应，并探讨其对体外DNA氧化损伤的保护作用及可能机制，为进一步研究丹酚酸药理作用提供科学依据。
1 材料与方法
11 仪器及色谱条件 LC-10A高效液相色谱仪(日本岛津公司)；DU600紫外-可见分光光度计(美国Backman公司)；Orion II高灵敏度板式化学发光检测仪(德国Berthold Detection Systems公司)。Alltima C18(150mm×46mm，5μm)色谱柱；流动相为水(05％冰醋酸)(A)-乙腈(B)；梯度条件：0～30min时5％～25％β,30～60min时25％～30％B；流速10ml/min；柱温为室温；检测波长280nm；进样量20μl。
12 试剂 丹酚酸B对照品(中国药品生物制品检定所，批号111562-200403);二苯代苦味酰肼自由基(DPPH)、DNA、维生素C(VC)(美国Sigma公司)；二丁基羟基甲苯(BHT)(上海凌峰化学试剂有限公司)；实验用水为超纯水(182MΩ)，其余试剂为分析纯。不同含量和组成的丹酚酸水提取物(AE)、乙酸乙酯萃取物(EE)、大孔吸附树脂纯化物(RE)(本实验室自制)。
13 方法
131 DPPH自由基清除法 参照文献〔4〕。反应体积为3ml，取05m1不同浓度的样品加入6×10-5mol/L的DPPH乙醇溶液中，混匀后室温下测定DPPH反应液在517nm处的吸光度。BHT、VC作对照比较。样品对DPPH的清除率(％)=［A0-A样)/A0］×100%。A0为DPPH对照在时间t=0时的吸光度值，A样为加有样品的DPPH t=30min时的吸光度值。
132 清除羟自由基及对DNA损伤的保护作用 参照文献〔5〕。采用邻菲罗啉(Phen)-CuSO4-VC-DNA体系检测清除羟自由基及对DNA损伤的保护作用。用01mol/L醋酸盐缓冲液(pH55)配制Phen-CuSO4-VC-DNA溶液，使Phen、Cu2+、VC和DNA的最终浓度分别为35×10-3mol/L、15×10-4mol/L,28×10-3mol/L、150μg/ml。加入一定量的样品(对照用缓冲液补齐)。取该溶液1ml，放入发光仪样品池中，加入200μl 30％的H2O2溶液，混匀，启动发光反应，连续测定发光强度(CL)。发光强度抑制率(％)=［(CL对照-CL样品)/CL对照］×100。
2 结果
21 丹酚酸清除DPPH自由基的能力 在本实验条件下，DPPH浓度在5～60μmol/L范围内与517nm下的吸光度有良好线性关系，Y=00104X+00051(R2=09999)。不同的丹酚酸在各浓度下对DPPH自由基均有清除作用，其清除能力与浓度在一定范围内呈量效关系。AE、EE、RE、VC、BHT对DPPH自由基的半数清除浓度(IC50)分别为1412，153，146，158，715μg/ml。其中，丹酚酸EE、RE和丹酚酸B在5～25μg/ml范围内随着浓度的增大，清除DPPH能力呈线性增加。当样品浓度进一步增大到50μg/ml后，其清除能力增加趋于平稳，清除反应的量效关系与VC相似。在5～200μg/ml浓度范围内,AE清除DPPH的浓度效应呈线性关系，浓度为200μg/ml时，AE清除DPPH的能力达到710％，接近于同浓度下BHT的水平。实验观察了不同样品在浓度为25μg/ml时对DPPH自由清除能力的动力学变化(30min)。AE、EE、RE在30min内吸收值均不断下降，超过30min后仍有下降趋势。而对照AsA在反应启动后，能快速清除DPPH自由基(6×10-5mol/L)，并达到平衡。
22 对羟自由基损伤DNA的保护作用 Phen-CuSO4-VC-H2O2-DNA化学发光体系中，Phen在金属离子的催化下与H2O2作用，生成羟自由基，产生最大发射在445～450nm范围内的化学发光。羟自由基引起DNA损伤，能产生一延迟于Phen本身氧化发光信号的慢化学发光。最大发光波长范围在380～420nm。丹酚酸混合物AE、EE和RE均能有效防止羟自由基引起的DNA损伤。当AE终浓度分别为200，500，1000，2000μg/ml时，DNA损伤产物发光峰延迟时间分别为180，240，400，1220s；发光抑制率分别为1374％，2664％，4650％，6893％。EE终浓度为25，50，160，200，400μg/ml时，DNA损伤产物发光峰延迟时间分别为320，420，520，940，1980s；发光抑制率分别为2713％，5617％，7152％，7696％，9067％。RE终浓度为25，50，100，150，200μg/ml时，DNA损伤产物发光峰延迟时间分别为340，400，800，960，1040s；发光抑制率分别为3824％，4863％，6326％，7649％。丹酚酸的加入能使DNA损伤产物发光峰较空白对照组有明显下降，且有明显后移现象，浓度越大，作用越强。AE、EE、RE的抑制发光50％的浓度(IC50)分别为12936，620,492μg/ml。浓度为200μg/ml时，丹酚酸AE、EE、RE的延迟时间大小顺序为RE>EE>AE。可见，丹酚酸对DNA氧化损伤的保护能力大小依次为RE>EE>AE。
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