【关键词】 力达霉素；,,烯二炔类抗生素；,,抗肿瘤
摘要： 带有烯二炔结构发色团的抗肿瘤抗生素力达霉素对肿瘤细胞有极强的杀伤力，是近年来发现的抗肿瘤活性较强的化合物之一，在肿瘤的化学治疗方面有良好的应用前景。本文介绍力达霉素的分子结构与生物合成、化学合成、分子作用机制与抗肿瘤活性、单克隆抗体高效偶联物、组合生物合成等方面研究的最新进展。
关键词： 力达霉素； 烯二炔类抗生素； 抗肿瘤
Advances in the research of lidamycin, an enediyne antitumor antibiotic
Ma Di and Hong Bin
(Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences,Peking Union Medical College, Beijing 100050)
ABSTRACT Lidamycin is an enediyne antitumor antibiotic with potent cytotoxicity against varieties of cancer cell lines. It is considered as one of the most effective natural products with antitumor biological activity found in recent years and is expected to have great potential on the chemotherapy of cancers. This article reviews the recent research progress of lidamycin, focusing on its molecular structure, biosynthesis, molecular mechanism of action, antitumor effects, conjugation with monoclonal antibody, as well as the prospective of combinatorial biosynthesis of this class of antibiotics.
KEY WORDS Lidamycin; Enediyne antibiotics; Antitumor
力达霉素(lidamycin，LDM)是从我国湖北省潜江县土壤分离出的一株放线菌Streptomyces globisporus C1027代谢产物中筛选出的1个新的大分子蛋白类抗肿瘤抗生素。力达霉素的化学结构中含有烯二炔结构的发色团，是烯二炔类抗生素中重要的成员之一。近两年来，由于烯二炔类的抗生素化合物分子构成新颖并有极强的抗肿瘤活性，已成为化学、药理学、分子生物学的研究热点。目前针对力达霉素的多方面的研究工作已取得的长足进展。现就力达霉素的分子结构与生物合成、化学合成、分子作用机制与抗肿瘤活性、单克隆抗体高效偶联物、组合生物合成等方面的研究工作成果作一综述。
1 力达霉素的分子结构与生物合成
力达霉素为新型烯二炔类抗肿瘤抗生素，它由1个辅基蛋白和1个发色团构成。蛋白部分由110个氨基酸组成，含有2个分子内二硫键，计算相对分子质量为10500u，蛋白质部分没有抗肿瘤活性，但对发色团有稳定和保护作用，并携带发色团到达肿瘤部位。发色团在抗肿瘤活性中发挥主要作用［1～3］，发色团由1个9元环1，5二炔3烯核心结构与氮氧杂萘甲酸、氨基吡啶核糖和β酪氨酸结合而成(Fig.1中1)。这些结构单元不但参与化合物分子的组成，而且与化合物的生物活性密切相关。借助核磁共振对辅基蛋白及其与发色团的复合物进行结构分析并确定各个结构单位的相对位置，发现芳构化的发色团结合在辅基蛋白结构中的“疏水口袋”处，它们之间的亲和性可能来自辅基蛋白“疏水口袋”区氨基酸侧链与发色团之间形成的静电和疏水作用［4］。发色团核心的烯二炔结构的生物合成途径一直是人们关注的焦点。烯二炔结构中首尾相接的乙酸结构单元曾被推测是由不饱和脂肪酸的前体被切割和环化后形成或是通过聚酮合成途径，由烯二炔聚酮合成酶催化聚线性不饱和聚酮中间产物的生物合成，接着采用一种新颖的环化机制而形成烯二炔核心结构。刘文等［5］运用PCR方法成功地克隆了力达霉素脱氧氨基糖代谢途径中的dNTP葡萄糖4，6脱水酶基因(sgcA)，并以此为探针，通过基因文库筛选和染色体步移克隆了完整的生物合成基因簇，发现力达霉素的生物合成起源于聚酮代谢途径，并确定了基因簇编码1个烯二炔聚酮合成酶SgcE，排除了由脂肪酸合成然后降解的可能性。除了聚酮合成酶SgcE，刘文等［5］还提出了一系列途径特异的结构基因分别控制各个结构单元的合成。sgcEsgcE11、sgcI、sgcJ、sgcL和sgcF等16个基因负责烯二炔核心的合成；sgcAsgcA6等7个基因sgcA1sgcA6参与脱氧氨基糖的合成；sgcCsgcC5等6个基因参与β氨基酸的合成sgcDsgcD6等7个基因负责杂萘苯环的合成。通过各自途径生物合成的这三个结构单元分别在糖基转移酶(SgcA6)、缩合酶(SgcC5)和酰基转移酶(SgcD6)的催化作用下，与烯二炔核心结合，构成完整的力达霉素发色团分子。对力达霉素生物合成基因簇中结构基因的研究正在进行中，通过生物信息学的分析、在链霉菌中的基因中断实验以及利用基因工程手段将结构基因的片段克隆至大肠埃希菌表达载体中并对表达产物进行酶学分析可以确定这些结构基因在力达霉素生物合成中的相关功能，并获取更多生物合成途径中有关中间产物和反应步骤的信息。目前已陆续报道了sgcD、sgcA1、sgcC1等结构基因的研究分析结果［6～10］。
Fig.1 The chromophore structure of lidamycin and it′s MasamuneBergman rearragement(polyketide synthase，PKS)（略）
2 力达霉素化学合成的研究
在力达霉素的化学结构得到解析后，很多实验室都进行着有关力达霉素化学合成方面的工作，希望通过化学手段可以合成出活性相当乃至更强的化合物。根据逆合成分析，朱锦桃等［11，12］合成了烯二炔发色团中五元环状中间体，并在此基础上合成了发色团中烯二炔单元的开链衍生物，但并未得到闭环的烯二炔结构。Inoue等［13，14］在对发色团的结构进行了充分研究之后对发色团的骨架结构和烯二炔的双环［7.3.0］结构进行了合成。由于辅基蛋白Gly96的H原子参与发色团芳构化后的自身降解，该实验室还利用同位素氘(D)取代辅基蛋白Gly96的H原子，改造后的辅基蛋白类似物由于动力学同位素的效应减小了发色团结构降解的速率，增加其稳定性［15］。Semmelhack等［16］报道了由甘露糖出发经12步反应合成力达霉素发色团氨基糖结构单元的路线，认为合成反应的关键步骤在于C4位的内部N取代从而引入顺式氨基以及C5位上烯醇化物的甲基化。
3 力达霉素的分子作用机制与抗肿瘤活性
3.1 分子作用机制力达霉素的发色团与DNA小沟相互作用，造成DNA损伤，且有序列特异性，为富含AT的区域。如CTTTT/AAAAG，ATAAT/ATTAT，CTTTA/TAAAG，CTCTT/AAGAG，特别是在GTTAT/ATAAC处［17］，力达霉素与双螺旋DNA小沟结合后插入DNA中，此时药物并未引起DNA的断裂，发色团(Fig.1中1)经MasamuneBergman重排后芳构化转变成有活性的双游离基中间体(Fig.1中2)，然后夺取DNA脱氧核糖上的氢原子(Fig.1中3)，在有氧条件下使核糖基团氧化，引起DNA单链、双链断裂或形成无碱基位点；在厌氧条件下DNA互补双链的脱氧核糖自由基与药物分子共价作用形成DNA的链内交联［18］。在力达霉素切割DNA的过程中自由基中间体的存在可以通过电子自旋共振(electronspin resonance，ESR)技术获得直接有力的证明［19］。
3.2 力达霉素对细胞DNA复制的影响力达霉素不但可以造成DNA断裂，同时还抑制DNA复制。用力达霉素处理SV40、EB病毒感染的细胞，然后通过研究SV40、EB病毒的DNA观察力达霉素对细胞DNA可能造成的影响。实验结果发现力达霉素抑制SV40、EB病毒DNA的复制，低浓度力达霉素抑制DNA复制可能与复制蛋白A(RPA)功能的丧失有关，而在高浓度的力达霉素作用下DNA断裂产生的片段可以诱导DNA依赖的蛋白激酶(DNAPK)活性增高，使其作为反式作用抑制因子影响DNA的复制［20～22］。
3.3 力达霉素引发细胞凋亡、细胞周期阻滞和细胞裂亡宋旭等［23］利用nucleic acid arrays的方法将细胞总cDNA进行膜杂交，可同时检测出大量基因表达的变化，发现力达霉素改变了HCT28细胞多种凋亡相关基因的表达水平，抑制RhoC的表达，促进TRAF3、DR4、DR5、MCH4、MCH6、TRIP、Apo23、ABLL和STAT1的表达，提示力达霉素可能是通过调节TNF受体家族有关的凋亡信号过程，诱导肿瘤细胞凋亡。用低浓度的力达霉素处理人肝癌BEL7402细胞，力达霉素促进凋亡相关基因cmyc、cfos的表达并抑制在肝细胞癌变中起重要作用的nras基因的表达，同时细胞骨架也发生了明显的变化，微丝排列更整齐，向正常细胞的微丝形态变化。力达霉素引起肿瘤细胞骨架有关组分的变化可能是其抗肿瘤活性的另一种解释［24］。有研究表明高剂量力达霉素处理人红白血病K562细胞引起S期细胞的比例明显升高，死亡细胞的比例明显增加，提示力达霉素引起DNA的损伤发生在S周期时，细胞周期检验点被激活，进而阻止DNA的复制，同时启动DNA修复机制，或者诱发细胞凋亡［25］。力达霉素对DNA的断裂损伤可以引发细胞周期的阻滞，实验结果显示力达霉素抑制内皮细胞增殖并诱导细胞凋亡，低浓度的力达霉素可使内皮细胞被阻滞在G/M1期；高浓度的力达霉素诱导细胞凋亡的发生。同时力达霉素改变内皮细胞中与增殖和凋亡相关的基因的表达，下调抗细胞凋亡蛋白Bcl2和PCNA的表达水平。细胞内游离钙离子浓度也显著的升高，提示由力达霉素引发的细胞凋亡可能与钙离子内流或影响钙离子依赖的下游信号传导通路有一定关联［26］。何其扬等［27］报道了力达霉素在BEL7402活细胞内直接切割DNA可形成梯度条带，并首次观察到染色质凝集的现象，而在其他烯二炔类抗生素诱导细胞凋亡的研究中均未见报道此现象。现已公认的细胞凋亡后期的共同途径是caspases(半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶)的激活。通过测定caspase的活性及与染色质凝集的关系，认为染色质凝集发生的时间早于caspase达到高峰的时间，而少量caspase的活化不足以解释大量的细胞发生染色质凝集的现象。这一现象提示这种染色质凝集的方式有别于典型的细胞凋亡。力达霉素引起细胞死亡(也被称为裂亡)的特征有别于典型细胞凋亡，而裂亡的引发可能与力达霉素诱导的细胞有丝分裂的异常(如中心体的过度复制、多极性纺锤体的形成、多核的形成等)有关［28］，力达霉素在HCT116细胞中造成染色体异常并破坏端粒区的功能，这是由于力达霉素诱导的大量双链DNA断裂引发细胞采取非同源末端结合(NHEJ)方式的修复途径，导致染色体发生错误连接［29］。
3.4 力达霉素对肿瘤细胞的抑制作用及实验治疗观察力达霉素对多种肿瘤细胞具有强烈的杀伤作用，对人肺癌、人鼻咽癌、人胃癌细胞等均有强烈的细胞毒作用。尚伯阳等［30］报道力达霉素对体外培养的肝癌细胞有高度杀伤作用。单核细胞直接细胞毒性测定(MTT)法测定结果表明，力达霉素对人肝癌BEL7402和小鼠肝癌22细胞增生有强烈的抑制作用，抑瘤率呈剂量依赖性。以IC50相比较，力达霉素细胞毒性比丝裂霉素C强10000倍以上。力达霉素对小鼠移植性结肠癌(皮下、盲肠、肝内)生长有明显抑制作用，对肝转移也有显著抑制作用，尤其是对较大转移灶有更强的抑制作用［31］。力达霉素的对肿瘤的抑制还表现在具有抑制肿瘤血管生成和抗侵袭作用。bFGF是重要的肿瘤血管生成因子，肿瘤生成时，储存于细胞基质中的bFGF被大量释放出来，同时肿瘤细胞中bFGF的基因表达及生物合成异常活跃。甄红英等［32］利用鸡胚尿囊膜模型证实力达霉素是很强的血管生成抑制剂。实验还证明力达霉素对bFGF与其受体结合有明显抑制作用，提示力达霉素抑制bFGF与受体结合，阻断bFGF在血管生成过程中诱导内皮细胞的增生和迁移，抑制血管生成、肿瘤生长及抗肿瘤转移。另有研究显示，力达霉素对侵袭调节基因的表达可产生一定影响，促进人结肠癌HCT8细胞TIMP21基因的表达，抑制MMP9基因的表达从而抑制IV型胶原酶的产生，同时又诱导金属蛋白酶抑制因子的产生，表现出抗侵袭活性［33］。力达霉素与其他临床常用抗肿瘤药物的联合应用可以表现出更强的抑癌效果，有实验观察到力达霉素可以增强顺铂诱导人肝癌BEL7402细胞凋亡，增强顺铂的抗肿瘤作用。顺铂与力达霉素单用均可使抗凋亡蛋白Bcl2的表达水平降低，而顺铂与力达霉素联合应用后则强烈抑制Bcl2的表达，几乎达到检测不到的水平，提示增效机制可能在于联合应用降低抗凋亡蛋白Bcl2的表达水平，导致线粒体膜电位降低，破坏线粒体膜的稳定性，线粒体内钙离子外流至细胞质，进一步诱导细胞凋亡［34］。最近有报道quinacrinenetropsin(QN)的杂交分子与力达霉素共同使用可以显著增强力达霉素诱导双链DNA断裂和细胞凋亡的程度，由于QN为DNA结合配体，加入QN后力达霉素可能与之形成异源二聚体后改变了和DNA序列结合的位点特异性，增强了在富含GC的区域，特别是5′AGG3′/3′TCC5′处的切割。因此，对DNA结合配体的研究可能成为增强力达霉素抗肿瘤活性、减小其化疗应用中副作用的一条有效途径［35］。
4 C1027与单克隆抗体高效偶联物的研究
力达霉素对肿瘤细胞的高效杀伤力使其极有可能成为新型高效抗肿瘤药物，但是缺乏肿瘤特异性的缺点限制了力达霉素应用于化疗。一种行之有效的增强特异性杀伤肿瘤细胞的方法就是将力达霉素作为高效“弹头”用于研制小型化导向药物。由于C1027分子构成的特点，可用多种方法将C1027与单抗连接。抗IV型胶原酶单抗3G11与力达霉素的偶联物3G11LDM与肿瘤细胞H22、HT29、C26呈现出良好的免疫结合活性和较高的抑癌活性。3G11LDM偶联物通过抗IV型胶原酶单抗3G11携带力达霉素到达肿瘤部位实现特异性结合，提高了在肿瘤部位释放的力达霉素的浓度，使其发挥更强的抑瘤作用［36］。完整的单抗分子与药物的免疫偶联物存在分子量大、对实体瘤穿透力差、易产生人抗体抗鼠反应(HAMA)等缺点，近年来设计高效化、小型化的单抗免疫偶联物也一直成为研究的热点。例如力达霉素与大鼠抗人肝癌细胞单抗3A5的Fab′片段的偶联物Fab′LDM，偶联物比游离力达霉素对靶细胞BEL7402细胞集落生成的抑制作用显著增强，偶联物与等剂量游离力达霉素比较，对小鼠移植性结肠癌26细胞显示出更强和更长时间的抑瘤作用［37］。以IV型胶原酶为治疗靶点，制备单抗3G11Fab′片段与力达霉素偶联的小型化免疫偶联物对肝癌细胞H22的细胞毒和治疗作用较游离力达霉素均有显著提高［38］。除化学偶联的方法外，利用基因工程技术将抗体Fv片段和C1027的烯二炔发色团制成分子量仅为387ku的融合蛋偶联物已获得成功。这也为利用基因工程进一步进行scFv与烯二炔偶联的研究奠定了基础［39］。
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