中药肝复健冲剂对大鼠肝纤维化形成的影响(1)

【关键词】  胶原

　　Influence of Ganfujian granule formula on process of liver fibrosis in rat

　　【Abstract】  AIM:  To investigate the effect of ganfujian granule on collagen sediment in rat hepatic fibrosis induced by diethylnitrosamine (DEN). METHODS: DEN induced live fibrosis model was established and ganfujian (GFJ) granule was administrated  as intervention measure. Influence (EFJ group) of ganfujian granule on collagen sediment and hepatocyte  proliferation  were examined by Picric acidSirus red staining  and immunohistochemical staing methods, and analyzed by computer image analysis technique. RESULTS: Collagen sediment in rat liver increased  gradually with the exacerbation of hepatic fibrosis in the model. Inflammatory damage and the degree of liver cirrhosis were lower GFJ group than in model group. Collagen sediment in  liver and  positive expression of proliferotive cell number ontgen (PCNA) in hepatocytes were decreased significantly in GFJ group (collagen sediment: 4 wk （15.20±2.21）vs（7.19±0.97）;12 wk （27.1±4.6）vs （16.0±1.7）.  positive expression of   PCNA in hepatocytes: 12 wk （21.1±0.32） vs （6.4±0.2）; 16 wk（31.1±7.1）vs（10.1±0.8） (P<0.05). CONCLUSION: GFJ  granule can inhibit and retard rats liver fibrosis by reduce collagen sediment in rat liver and may prevent liver cirrhosis transit to hepatocarcinoma in some degree by inhibit overproliferating of hepatocytes.

　　【Keywords】ganfujian granule;  traditional medicine; liver cirrhosis; collagen

　　【摘要】  目的： 观测中药肝复健冲剂对二乙基亚硝胺（DEN）诱导大鼠肝纤维化形成的影响. 方法： 建立DEN诱导大鼠肝硬化模型，同时给予肝复健冲剂进行干预，应用天狼红苦味酸特染法、免疫组化染色法及计算机图像分析技术检测中药对DEN致大鼠肝纤维化过程胶原沉淀及肝细胞增殖特性的影响. 结果： 随着模型大鼠肝纤维化程度加重，肝内胶原沉积量亦呈逐渐增加趋势. 中药组大鼠肝脏炎性损害及肝纤维化程度均较同期模型组大鼠轻，胶原沉积量及细胞增殖核抗原(PCNA)阳性着色肝细胞数明显减少，两组间差异有统计学意义, P<0.05［胶原沉积量：4 wk（15.20±2.21）vs  （7.19±0.97）; 12 wk（27.1±4.6） vs （16.0±1.7）. 阳性表达PCNA肝细胞数：12 wk（21.1±0.32） vs （6.4±0.2）;16 wk（31.1±7.1）vs （10.1±0.8）］. 结论：  中药肝复健冲剂可通过减少肝内胶原沉积及可能恶性增殖的肝细胞，抑制和延缓实验性动物肝纤维化的形成，并一定程度上预防肝硬化向肝癌的转变.

　　【关键词】 肝复健冲剂；肝硬化；胶原

　　0引言

　　HBV感染患者和几乎全部HCV携带者有可能发展为肝硬化，亦是造成肝硬化发病率居高不下的主要原因，而肝硬化中约30%患者可并发肝癌［1］. AFP升高、肝硬化伴细胞不典型增生或细胞增殖活性增高成为肝癌发病的高危因素［2］，因而慢性肝病、肝硬化的防治十分重要. 如何延缓肝纤维化形成进程或逆转至正常，已成为肝硬化及肝癌防治的中心问题. 因此，研制有效且可长期服用的预防制剂也越来越引起人们的关注. 健脾扶正法是中医临床防治肝硬化与肝癌常用的方法之一［3］. 本科室根据中医基础理论及临床实践研制的以健脾益气立法，由淮山药、山楂、大枣等药食同源中药组成的肝复健冲剂，在临床肝硬化防治过程中取得较好疗效.

　　1材料和方法

　　1.1材料SD雄性大鼠，体质量150~180 g，由第四军医大学实验动物中心提供. 二乙基亚硝胺(DEN)购自Sigma公司. 天狼红（解放军第475医院赠送）. PCNA检测试剂盒购自DAKO公司. 中药饲料：肝复健冲剂按30.4 g・kg-1均匀混合于基础饲料中压制而成（第四军医大学实验动物中心提供）.

　　1.2方法

　　1.2.1模型建立大鼠适应环境3 d随机分为模型组（Model）及中药组(Ganfujian，GFJ)，每组各30只，分别以0.1 g・L-1 DEN自由饮水，同时分别给予基础饲料或含中药的饲料喂养. 16 wk时停用DEN饮水及中药饲料. 考虑到造模过程大鼠有一定死亡率，分别于建模开始后每4 wk两组各处死5只大鼠，剩余大鼠留继续观察. 取肝组织固定于100 g・L-1甲醛溶液，石蜡包埋，切片厚4 μm. 常规HE染色、切片胶原特殊染色及免疫组化染色.

　　1.2.2切片胶原染色按天狼红饱和苦味酸法［4］. 普通石蜡切片,厚4 μm;常规脱蜡至水,0.1 mol・L-1天狼红饱和苦味酸,避光室温孵育20 min;不洗,950 mL・L-1乙醇脱水,二甲苯透明,封片.

　　1.2.3PCNA免疫组织化学染色取材肝组织固定于100 mL・L-1缓冲甲醛溶液24 h，常规石蜡包埋，切4 μm厚切片，二甲苯、梯度乙醇脱蜡至水；染色方法为免疫ABC法. 以0.1 mol・L-1 PBS 取代一抗作阴性对照，以正常大鼠肝组织作正常对照.

　　1.2.4染色结果判定及计算机图像分析肝脏背景为淡黄色，胶原阳性着色呈红色, 采用HPIAS1000高清晰度彩色病理图文分析系统,随机选择5个汇管区进行染色胶原的定量分析(面积占视野面积),取其均值. PCNA阳性着色为覆盖胞核的棕黄色颗粒. 用网格（10×10）测试法计数阳性肝细胞. 切片各选择10个按同一方向移行、不重叠的高倍镜视野（×40），记数阳性及阴性细胞数（100个细胞）.

　　统计学处理：采用SPSS统计分析软件对所获得的数据进行组间秩和检验.

　　2结果

　　2.1大鼠肝纤维化过程组织形态学变化模型组大鼠使用DEN 4~8 wk时肝表面由平滑逐渐变为粗糙，可见小颗粒，呈局灶性. 光镜下肝细胞肿胀，空泡变性，局灶性坏死，伴炎细胞浸润，并逐渐出现纤维组织增生. 12 wk时40%大鼠已出现明显肝硬化，肝表面更加粗糙，肝脏增大、肿胀，色暗或淡. 16 wk时大鼠均有肝硬化表现，结节增多变大，肝脏缩小，组织学有大量形态不一，大小排列不齐的假小叶形成. 部分大鼠肝脏已出现早期癌结节，镜下可见少量癌细胞增生. 中药组大鼠各时期肝脏损害均较单纯诱导组轻，12 wk无肝硬化大鼠，16 wk 50%大鼠出现肝硬化，但未发现癌变.

　　2.2大鼠肝纤维化过程肝内胶原沉积变化模型组大鼠4 wk肝内即出现少量红色胶原阳性染色，多集中于汇管区. 随着肝内病变加重，假小叶的形成，肝脏沉积的胶原逐渐增多， 16 wk病变以结节性肝硬化为主，切片胶原沉积量亦达到顶峰. 中药组大鼠肝内病变较模型组明显减轻，肝硬化发生晚，肝内胶原沉积量少，在4 wk及12 wk两组间差异有统计学意义(P<0.05, Tab 1).

　　表1两组大鼠肝脏胶原沉积的比较　(略)

　　2.3大鼠肝纤维化过程肝细胞阳性表达PCNA情况在模型初期即可见少量肝细胞PCNA阳性着色，随着模型进展，大鼠肝脏PCNA阳性表达的肝细胞数目逐渐增加，并在12～16 wk呈明显攀升趋势. 中药组大鼠PCNA阳性的肝细胞数在各期均低于模型组，其中12～16 wk差异显著(P<0.05, Tab 2).

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