白藜芦醇联合5(1)

                          作者：李燕，邢克飞，李福洋，汪云，药立波，刘新平 

【关键词】  白藜芦醇

    Apoptosispromoting effect of resveratrol combined with 5FU on human breast cancer cell line MCF7

　　【Abstract】 AIM: To investigate whether 5FU in combination with resveratrol can accelerate the apoptosis of human breast cancer cell line MCF7 in vitro. METHODS: Four breast cancer cell lines (MCF7, MDAMB231, SKBR3 and Bcap37) were incubated with different concentrations of resveratrol or/and 5FU for 48 h, then cell survival rate was measured by MTT assay and cell morphological change was observed by phase contrast microscope. Apoptosis was detected by flow cytometry (Annexin V/PI staining) analysis and Hoechst33258 staining. RESULTS: Resveratrol could inhibit the growth of MCF7, MDAMB231, SKBR3 and Bcap37 to different extents. The IC50 values of resveratrol in MCF7, MDAMB231, SKBR3 and Bcap37 cells were 65, 207, 139 and 213 μmol/L, respectively. The IC50 value of 5FU in MCF7 cells was 13 μmol/L. When 5FU and 65 μmol/L resveratrol were combined, the IC50 value of 5FU in MCF7 cells was decreased to 9 μmol/L. Compared with the treatment with 13 μmol/L 5FU or 65 μmol/L resveratrol alone, the percentage of Annexin V(+)/PI(-) MCF7 cells increased when these 2 drugs were used in combination. The number of apoptotic MCF7 cells calculated with flow cytometry was accordant with the result got with Hoechst33258 staining. CONCLUSION: Resveratrol interacts synergistically with 5FU to induce the apoptosis of MCF7 cells, which suggests that resveratrol is a secondary chemotherapeutic medicine for treating breast cancer.

　　【Keywords】 resveratrol; chemotherapy; apoptosis; breast neoplasms

　　【摘要】 目的：研究白藜芦醇联合5FU促进人乳腺癌细胞MCF7凋亡的作用. 方法：4种人乳腺癌细胞系（MCF7，MDAMB231，SKBR3和Bcap37）与不同浓度的白藜芦醇或／和5FU共孵育48 h，MTT法检测细胞存活率,并用相差显微镜观察细胞形态学改变. 用流式细胞术(检测细胞凋亡相关指标Annexin V/PI）和Hoechst33258染色检测细胞凋亡. 结果：白藜芦醇能够不同程度地抑制4种人乳腺癌细胞系（MCF7， MDAMB231，SKBR3和Bcap37）的生长. 白藜芦醇对MCF7，MDAMB231，SKBR3和Bcap37细胞的IC50（半数抑制浓度）分别为65，207，139和213 μmol/L. 单用5FU对MCF7细胞的IC50为13 μmol/L，联合使用5FU和白藜芦醇的IC50分别为9 μmol/L和3 μmol/L. 与单用组相比，65 μmol/L白藜芦醇和13 μmol/L 5FU联合使用后，MCF7细胞Annexin V水平升高. Hoechst33258荧光染色和流式细胞术分析MCF7细胞的结果一致. 结论：白藜芦醇与5FU合用可协同促进MCF7细胞凋亡，提示白藜芦醇可能用作治疗乳腺癌的二线化疗药.

　　【关键词】 白藜芦醇；化疗；细胞凋亡；乳腺癌

　　0引言
  
　　中药植物的提取物与化疗药物的合理配伍，可大大提高肿瘤治疗的疗效. 白藜芦醇(resveratrol)化学名称为芪三酚，化学结构为3，5，4’三羟基二苯乙烯(3，5，4’_trihydroxystilbene)，分子式C14H12O3，Mr 128.25，属非黄酮类多酚化合物，白藜芦醇可拮抗消化、血液、呼吸、生殖等多个系统来源的多种肿瘤细胞的增殖［1-4］，对肿瘤细胞的发生、促进、发展3个阶段均有抑制作用［1］. 本研究将白藜芦醇与临床常用化疗药5FU联合应用，观察其对5FU在促进细胞凋亡中的增效作用.

　　1材料和方法

　　1.1材料四种人乳腺癌细胞系MCF7，MDAMB231，SKBR3和Bcap37均为本室保存细胞；白藜芦醇（纯度大于99％，溶于500 g/L的丙二醇）由西安绿康天然药物研究所提供，用时用含10％小牛血清的RPMI 1640细胞培养液稀释至工作浓度；5FU购于第四军医大学附属一院西药房；RPMI 1640培养基为美国Gibco公司产品；小牛血清购自杭州四季青生物材料工程有限公司；四氮唑溴盐（MTT）、Annexin V/PI双标试剂盒和Hoechst33258购自美国Sigma公司；其余试剂均为国产分析纯. BX60荧光显微镜和倒置相差显微镜及照像系统为日本Olympus产品；遥控酶标分析仪为奥地利TECAN公司产品；FACSCalibur流式细胞仪为美国BD公司产品.

　　1.2方法

　　1.2.1MTT法测定细胞存活率参考Yamaue等［5］的方法采用对数生长期的细胞，倾出其培养液，用PBS洗细胞3次，加适量的胰蛋白酶消化并细胞计数后，将细胞按4×103~6×103/孔（不同种类细胞接种密度不同）分组加入96孔培养板，每孔200 μL. 按细胞系、化疗药品种及药物浓度分组，白藜芦醇实验组分为6个浓度组：2, 20, 40, 80, 200和400 μmol/L；5FU实验组参照其在人体的血浆高峰浓度，选择其最高峰值浓度的0.1~20倍范围，分为6组：8, 80, 160, 320, 800和1600 μmol/L；联合用药实验组分为6组，分别是8, 80, 160, 320, 800和1600 μmol/L 5FU与65 μmol/L白藜芦醇联用. 每种药物浓度接种5复孔，每组设阴性对照组（培养液中只有细胞，无药物）和空白对照组（培养液中只有等量的药物，无细胞）. 细胞常规培养24 h后，将培养液换成含不同浓度药物的培养液，培养板置于CO2培养箱，在37℃，50 mL/L CO2条件下继续培养48 h，倒置相差显微镜观察细胞生长状态并拍照. 然后取出全部培养板，每孔加入MTT溶液（5 g/L） 20 μL，再继续培养4 h，小心吸出培养液，每孔加入150 μL二甲基亚砜，振荡10 min，使沉淀充分溶解，用酶标仪在490 nm波长下测定光密度，计算肿瘤细胞存活率. 计算公式为：细胞存活率＝(实验组光密度－空白对照组光密度)／（阴性对照组光密度－空白对照组光密度）×100％.

　　1.2.2流式细胞仪分析细胞凋亡根据Annexin V/PI双标试剂盒说明，用双蒸水1∶4稀释结合缓冲液，PBS洗涤样品细胞后，以稀释的结合缓冲液重悬细胞，并调整细胞浓度为2×105~5×105／mL. 取195 μL细胞悬液，加入5 μL Annexin V混匀，室温反应10 min，PBS洗细胞一次，再以190 μL稀释的结合缓冲液重悬，加10 μL (20 μg／mL) PI，用流式细胞仪分析. 每样本收集1×104个细胞荧光信号，采用Cellquest软件分析结果.

　　1.2.3Hoechst33258荧光染料染色观察细胞核形态的改变药物处理后的细胞用PBS洗涤并重悬，加入浓度为5 μg／mL的Hoechst33258荧光染料反应10 min，于荧光显微镜下观察并拍摄图像. 观察细胞核形态，以细胞萎缩、核固缩、染色质凝聚和荧光强度增强等作为凋亡细胞指征.

　　统计学处理：数据以x±s表示，采用SPSS 8.0统计软件进行分析. 行多个独立样本两两比较的Nemenyi法检验，P<0.05为差异有统计学意义.

　　2结果

　　2.1MTT实验检测细胞存活率①白藜芦醇对4种乳腺癌细胞生长的抑制作用：MTT实验检测细胞存活率并绘制细胞生存曲线，曲线表明白藜芦醇能抑制4种乳腺癌细胞的生长，测得白藜芦醇对MCF7细胞的IC50 (半数抑制浓度)为65 μmol/L，对MDAMB231，SKBR3和Bcap37细胞的IC50分别为207，139和213 μmol/L（图1）. ②5FU和白藜芦醇联用对MCF7细胞生长的影响：MTT实验测得，5FU单独作用于MCF7细胞的IC50为13 μmol/L，5FU和65 μmol/L白藜芦醇联合使用作用于MCF7的IC50降低到9 μmol/L.

　　图1白藜芦醇对人乳腺癌细胞系MCF7，MDAMB231，SKBR3和Bcap37生长的抑制作用（略）

　　2.2倒置相差显微镜下观察细胞形态随着药物浓度的增加，与阴性对照组相比，白藜芦醇实验组中MCF7细胞数量逐渐减少，细胞形态发生明显改变. 5FU实验组与阴性对照组相比，在较低的药物浓度下，细胞的数量和形态就有明显变化，但很快进入平台期，随药物浓度的增加，细胞的数量和形态变化不明显. 联用5FU和白藜芦醇于MCF7细胞，与阴性对照组相比，48 h后镜下可见到：随着药物浓度的增加，细胞数量逐渐减少，细胞形态发生明显改变，没有出现平台期（图2）. 且上述细胞形态学改变与MTT实验结果具有相同的趋势.

　　2.3Annexin V/PI检测细胞凋亡凋亡早期，细胞内膜的磷脂酰丝氨酸移位到细胞外膜，荧光标记的Annexin V极易与细胞外膜的磷脂酰丝氨酸结合从而使其染色. MCF7细胞经65 μmol/L白藜芦醇联合13 μmol/L 5FU处理48 h，细胞凋亡率明显高于两药分别单用（n=3，P<0.05），其中联用组细胞凋亡率为（81.6±4.3）％；而65 μmol/L白藜芦醇、13 μmol/L 5FU和对照组分别为（14.1±2.8）％，（41.3±3.5）％，（0.3±0.2）％.

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