作者：叶丽娟 朱辉 田敏 黄晓莉
【摘要】 链霉菌H6794的发酵产物对真菌细胞壁合成具有抑制作用，采用活性追踪的方法分离到活性化合物H6794-A。通过化学及波谱学分析确定为由7个氨基酸和1个长支链酰胺内酯构成的环脂肽，与neopeptin B同质。H6794-A对番茄灰霉病菌、小麦赤霉病菌和黄瓜枯萎病菌有明显的抑制作用。
【关键词】 真菌细胞壁 抗菌活性
Structure elucidation and activity of compound H6794┐A，a fungal cell wall inhibitor
ABSTRACT Compound H6794-A，which possessed inhibitory activity against fungal cell wall synthesis，was isolated from culture broth of Streptomyces sp.H6794.The antifungal compound was elucidated to be structrally identical to a cyclic lipopeptide——neopeptin B by chemical and spectral analysis.Results showed that H6794-A could inhibit growth of Fusarium graminearum，Fusarium oxgsporum and Botrytis cinerea.KEY WORDS Antifungal compound; Fungal cell wall inhibitor; Neopeptin B
真菌病害是影响农作物产量的主要原因之一，每年植物因病害造成的减产达15%［1］ 。化学农药对植物病害的防治扮演了重要的角色，但随着人们对化学农药的毒性及残留问题的日益重视，开发高效低毒的生物农药已成为亟待解决的问题。由于哺乳动物细胞中没有细胞壁，真菌细胞壁抑制剂对人体的影响相对较小 ［2］ 。在筛选真菌细胞壁抑制剂的过程中得到一株链霉菌H6794。为确定其抗真菌活性成分，以粗糙脉胞霉原生质体为模型，采用活性追踪的方法分离到H6794-A。本文报道该活性产物的分离纯化、结构鉴定及活性研究。
1 材料与方法
1.1 菌株分离与培养
（1）产生菌 从中国西藏自治区曲积县的土壤中分离获得，编号H6794。
（2）培养基 斜面培养基:ISP3;种子培养基（%）:可溶性淀粉2.5，葡萄糖1，酵母粉0.5，黄豆粉0.5，CaCO3 0.2;发酵培养基（%）:燕麦2，葡萄糖1，糊精2.5，蛋白胨1，酵母粉0.5，KH2 PO4 0.05，CaCO 3 0.2，pH7.0。从28℃培养7d的ISP3斜面上取适量菌体，接种于种子培养基中，28℃220r/min培养2d;将该种子培养液按10%接种量接种于发酵培养基，28℃220r/min培养6d。
1.2 活性测试
采用改良的Selitrennikoff方法［3］ ，结合倒置显微镜观察原生质体的再生情况。
1.3 活性产物的分离纯化
发酵液经大孔吸附树脂柱，正丁醇萃取，菌丝用丙酮浸提后浓缩，正丁醇萃取。合并正丁醇萃取液，浓缩，硅胶柱层析分离，得到黄褐色粉末。进一步以制备液相色谱分离。制备柱:Hypersil C
18 （10.0mm×150mm，5μm），流动相:45%乙腈∶水（0.015%甲酸）;流速5ml/min;检测波长210nm。收集H6794-A组分，蒸干得纯品。
1.4 结构鉴定
（1）谱学方法
仪器 EPI QSTAR质谱仪;NICOLET200SXV FT-IR红外光谱仪;Bruker Avance600核磁共振仪。5mg H6794-A溶于0.5ml DMSO中，由Varian Unity INOVA-400仪记录氢信号;重水交换溶剂为CD 3 COCD 3 和D 2 O;50mg H6794-A溶于0.5ml DMSO中，记录 13 C-NMR、DEPT、HMQC和HMBC图谱。
（2）化学方法
酸水解 称取一定量H6794-A，加入6mol/L HCl，酒精喷灯封口，110℃烘箱中水解2h。采用改良的Merfey方法 ［4］ 将酸水解产物转化成FDLA衍生物，并通过LC/MS（Agilent1100）鉴定构成H6794-A的氨基酸组成。
碱水解 由于环状化合物在质谱仪中不容易打出碎片，因而对H6794-A进行开环处理。5mg H6794-A溶于5ml0.035mol/L NaOH，37℃水解12h，HCl中和至pH7.0。正丁醇萃取水解液，将萃取液蒸干，质谱测定碱水解得到的开环化合物。
1.5 抗植物致病真菌活性
供试菌 小麦赤霉病菌（Fusarium graminea-rum）、黄瓜枯萎病菌［Fusarium oxgsporum（Sch1）f.sp cucumerium Owen］、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea Pers）均分离自患病植株。
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