肿瘤相关抗原在人大肠癌中的表达(1)-找论文网

作者：冯慧，伊德林，曾艳，刘芙蓉，方瑾，宋今丹

【摘要】 目的应用ND1单抗和抗CEA单抗对大肠癌细胞的标记情况对比，探讨LEA在大肠癌中的表达及意义。方法采用流式细胞仪和免疫细胞化学染色检测大肠癌细胞系LEA和CEA的表达。并采用间接ELISA法测定LEA和CEA单抗对大肠癌细胞系的特异性。应用免疫组化检测其在大肠癌组织中的表达。结果流式细胞仪检测显示，LEA抗原在CCL187、CX1、CLone A和CCL229细胞表达的阳性峰平均荧光强度呈递减趋势，并且强于CEA的表达量(P<0.01)。LEA在高分化大肠癌细胞系CCL187和CX1高度表达，并且低侵袭大肠癌细胞系CCL187和CX1 LEA表达量高于高侵袭大肠癌细胞系CLone A和CCL229(P<0.01)。ELISA检测表明，与抗CEA单抗相比，ND1单抗对大肠癌细胞具有很强的特异性结合力(P<0.01)。LEA的表达阳性率随大肠腺癌组织分化程度降低而下降(P<0.01)，而且对高分化腺癌表现出更高的选择性。抗CEA单抗对高、中、低分化癌选择性相似(P>0.05)。结论 LEA是更加特异的高分化大肠癌相关抗原。LEA可能与癌细胞的分化程度、侵袭力、恶性程度有关， LEA可作为早期诊断和判断大肠癌恶性程度的有用指标。

【关键词】 肿瘤相关抗原；大肠癌细胞; 表达

　　Expression of Tumorassociated Antigen in Colorectal Carcinoma

　　Abstract：Objective This study was designed to evaluate the expression and its significance of colorectal carcinomaassociated antigen LEA in colorectal carcinoma cells through the comparison of a new monoclonal antibody (ND1) and antiCEA monoclonal antibody.Methods Expression of LEA and CEA in colorectal carcinoma cells was detected with immunocytochemistry and flow cytometry . The specificity of LEA and CEA in colorectal cancercells was analyzed by ELISA, and to detect the expression of LEA in colorectal cancer tissues with immunohistochemical method.Results Flow cytometry detection showed that positive peak mean fluorescence intensity was gradually decreasing in the expression of LEA in CCL187,CX1,CLoneA and CCL229,and stronger than that of CEA(P<0.01). LEA was highly expressed in the well differentiated colorectal cancer cells of CCL187 and CX1,and its expression amount in low invasive cell lines of CCL187 and CX1 was higher than high invasive ones of CLoneA and CCL229(P<0.01).ELISA analysis revealed that monoclonal antibody ND1 had stronger specific binding activity to the colorectal carcinoma cell lines as compared to the CEA(P<0.01).The expression of LEA was decreased following the drop of tumor differentiation degree(P<0.01)and exhibited higher selectivity in well differentiated colorectal cancer(P<0.01).CEA had similar selectivity in well, moderately,and poorly differentiated colorectal cancer(P>0.05).Conclusion LEA is more specific well differentiation colorectal carcinomaassociated antigen. LEA may be related to the differentiation degree, invasiveness and malignancy degree of cancer cells. LEA can be used as a useful measurement for the early diagnosis and malignancy degree of colorectal carcinoma.

　　Key words：Tumorassociated antigen; Colorectal cancer cells; Expression

　　0 引言

　　大肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。其发生是一个以原癌基因激活和抑癌基因失活为基础的多步骤、多阶段的过程。目前，晚期大肠癌的5年生存率并无多大改观[1]。提高大肠癌治愈率的关键在于早发现、早诊断、早治疗。因此寻找理想的特异性强、敏感性高的肿瘤相关抗原是提高防治的重要手段之一。CEA（Carcinoembryonic antigen ，CEA）是最早发现的大肠癌血清肿瘤标志物，即癌胚抗原[2]，分子量约为180kD的糖蛋白，编码基因位于19号染色体，CEA在大多数恶性肿瘤血清中均有不同程度升高，特异性较低，对大肠癌的早期诊断价值不高。1986年宋今丹教授在美国哈佛大学进行合作研究期间，用人大肠癌细胞系CCL187作为免疫原，将获得的单克隆抗体命名为ND1，将其所识别的大肠癌细胞表面肿瘤相关抗原命名为LEA(Large External Antigen, LEA) [3]。生物学特性研究表明，LEA是一种大分子量的可溶性大肠癌相关抗原，位于细胞表面的细胞膜，分子量大于500kD，属糖蛋白。本研究应用抗人大肠癌单克隆抗体ND1与抗CEA单抗在大肠癌细胞表面的标记情况作比较，进一步证明抗人大肠癌细胞膜表面抗原（LEA）的单克隆抗体（ND1）有很高的特异性，为应用此抗体进行大肠癌临床病理辅助诊断、血清学检测和导向治疗等提供重要的实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料

　　1.1.1 动物与细胞 Balb/c纯系小鼠由本校实验动物部提供，动物合格证号：省动字01110，分泌抗人大肠癌mAb ND1的鼠杂交瘤细胞株IC2由宋今丹研制建株，人大肠癌细胞系CCL187、CX1、CCL229和CLone A均由美国哈佛大学医学院DanaFarber肿瘤研究所惠赠，人宫颈癌细胞系HeLa由哈佛大学赠送。

　　1.1.2 试剂与仪器 RPMI1640、DMEM培养基为Sigma公司产品,抗LEA单克隆抗体由本室研制；降植烷为Sigma公司产品；FITC标记羊抗小鼠IgG单克隆抗体为Sigma公司产品;抗CEA单抗、SP试剂盒购自ZYMED公司；辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG购自Jackson公司；TMB购自Boehringer Mannheim公司。Sorvall RC28S,Du Pont超速离心机；Pharmacia HiTrap protein G 柱；Becton Dickinson流式细胞仪；LABSYSTEMS酶标仪。

　　1.1.3 标本来源本研究所用石蜡包埋组织标本选自中国医科大学第二附属医院普外科大肠癌患者标本及结肠镜活检标本共238例，并经HE染色病理证实，其中大肠癌170例，按“全国大肠癌病理学研究统一规范”组织学分类标准，其中高分化癌48例，中分化癌65例，低分化癌27例，粘液腺癌24例,印戒细胞癌6例；大肠非癌组织68例作为对照观察，其中大肠腺瘤41例，正常大肠粘膜27例。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 单克隆抗体的制备、纯化与鉴定按常规方法用降植烷免疫出生6～8周龄的Balb/c纯系雌鼠,7～12d后腹腔注射杂交瘤细胞株IC2，收集腹水4℃离心，上清4℃透析1～2d。经0.22μm滤膜过滤后注入HiTrap protein G柱（柱床体积5ml）纯化。Lowry法测定纯化前后的抗体蛋白浓度。SDSPAGE 测定ND1单克隆抗体纯度。

　　1.2.2 间接免疫荧光法检测抗体活性取对数生长期的人大肠癌细胞CCl187和人宫颈癌上皮细胞HeLa分别传代于盖片上，37℃培养2～3d后，以被检样品ND1单抗和抗CEA单抗为一抗，FITC标记的羊抗鼠IgG荧光抗体为二抗，37℃下暗处作用30min。PBS冲洗后，在荧光显微镜下观察。PBS为第一抗体作阴性对照。

　　1.2.3 间接酶联免疫吸附试验（ELISA）测定抗体生物活性、效价测定及特异性取对数生长期的CCL187和HeLa细胞，以2～5×105/ml、100μl/孔，培养24～48h，以PBS洗板1次。0.05%戊二醛 4℃ 固定15min。PBS洗3次。1%BSAPBS 4℃封闭过夜。PBS涮洗后每孔加等摩尔ND1单抗和抗CEA单抗50μl/ 孔，室温孵育1h，PBS洗3次。加二抗辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG 50μl /孔，室温孵育1h。PBS洗3次后加底物TMB 100μl/孔，暗处反应15min，加2mol/L H2SO4 50μl/孔，终止反应。在酶标仪上于波长450nm 测定吸收值。同时设空白对照及以PBS代替第一抗体作阴性对照。

　　1.2.4 LEA和CEA抗原在大肠癌细胞的表达

　　1.2.4.1 免疫细胞化学染色观察按试剂盒说明（SP法）进行操作。CCL187和HeLa细胞作为抗原对照，利用PBS代替第一抗体作阴性对照。取对数生长期的细胞，分别接种于盖片，于37℃培养48h，4%多聚甲醛4℃固定30min，PBS洗3次，3%H2O2灭活内源性过氧化物酶10min，PBS洗3次， 10%正常羊血清阻断非特异性反应15min，滴加第一抗体ND1和抗CEA单抗50μl，湿盒中37℃孵育1h，PBS洗3次，滴加生物素标记的第二抗体50μl ，37℃孵育15min，PBS洗3次，滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素50μl ，37℃孵育15min，PBS洗3次，100μl DAB显色3～10min，苏木素复染5min，酒精系列脱水，二甲苯透明，中性树胶封片后镜下观察。

　　1.2.4.2 流式细胞仪检测将CCL187、CX1、CCL229和CLone A每种细胞分成3组，分别检测LEA与CEA抗原，第3组以PBS代替一抗作阴性对照。将上述对数生长期的细胞，消化后制成单细胞悬液，PBS（含1%BSA）洗3次，多聚甲醛固定1h，PBS洗3次，调整细胞浓度至1×107/ml, BSA 30min，封闭非特异位点，取每种细胞悬液100μl，分别加ND1单抗，抗CEA单抗、PBS 50μl ，置4℃，45min，1 500 r/min离心5 min， PBS洗3次，重悬于100μl PBS,避光加入FITC标记的羊抗鼠IgG，置4℃，45 min。1 500r/min离心5 min，PBS洗3次，重悬于1.0ml PBS中，在激发波长为488nm下上FACSort测定5 000～10 000个细胞的平均荧光强度，采用CellQuest 分析软件分析抗原表达量。用PBS代替一抗作为阴性对照。

　　1.2.4.3 免疫组织化学染色采用SP法进行染色，每批染色严格注意条件相同，并设对照。阴性对照以PBS替代一抗，已知LEA和CEA阳性的大肠癌组织作阳性对照。结果判定：光镜下观察有棕黄色颗粒出现在细胞膜、细胞浆、腺腔及细胞外粘液中为阳性反应。阳性细胞数占视野10%以上为阳性标准。

　　1.3 统计学处理

　　所有资料上机采用SPSS10.0软件包对数据进行统计学分析。对计量资料，数据以±s表示，用方差分析进行统计学检验；计数资料，实验数据采用χ2检验进行统计学分析。

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