2 结果
2.1 单克隆抗体ND1的活性及纯度鉴定
间接免疫荧光法检测各洗脱峰结果表明，只有第二峰收集液的ND1抗体阳性，且纯化后的抗体活性良好。SDSPAGE分析显示，第二峰为IgG的单一组分，在Mr55 000和Mr25 000处显示为均一的两条带，分别为LgG的重链和轻链。纯度较好。间接ELISA结果表明ND1抗体纯化后浓度为1mg/ml时，抗体效价为1∶10 000。
2.2 LEA、CEA抗体特异性检测
ND1单抗与CCL187细胞表面抗原结合，整个细胞膜均显示黄绿色荧光，呈一光环。细胞内及背景不发光，见图1。LEA主要分布在CCL187细胞膜表面，在细胞表面的某些区域还有高度亮的荧光聚集。ND1单抗对非大肠癌HeLa细胞表面未显示荧光。CEA在CCL187细胞表面呈弱阳性，在细胞表面少量表达，呈现分散颗粒状均匀分布。ELISA 定量检测表明ND1单抗与CCL187细胞的结合性高于同HeLa细胞，其差异有统计学意义(P<0.01)，而抗CEA单抗与CCL187和HeLa细胞结合性差异显著(P<0.05)，与抗CEA单抗相比，ND1单抗对大肠癌细胞具有很强的特异性结合力(P<0.01)。
2.3 免疫细胞化学染色
LEA在CCL187细胞内呈强阳性反应，细胞内有大量浓染的棕色成团区，细胞膜尤为明显，见图2。CEA在CCL187细胞内呈弱阳性反应，细胞内有散在的棕黄色淡染区。LEA 在HeLa细胞内呈阴性反应，无棕黄色区域。而CEA呈弱阳性反应。
2.4 FACS检测大肠癌细胞系表面LEA、CEA抗原的表达
4种细胞CCL187、CX1、CLone A和CCL229 LEA的平均荧光强度分别为2 832.45±38.63、932.83±18.17、366.52±31.24、201.07±13.41,有明显差异(P<0.01), 呈递减趋势，LEA可被证明为细胞膜表面抗原，在4种高分化大肠癌细胞系CCL187、CX1、CLone A和CCL229高度表达且表达量不同(P<0.01),见图3，这与先前结论一致[3]。而CEA的平均荧光强度分别为35.12±6.38、23.68±4.47、0.49±0.02、0.28±0.05,CEA主要为CCL187和CX1细胞表面抗原。可见，在这4种大肠癌细胞系中LEA的表达量高于CEA(P<0.01)。
2.5 免疫组织化学染色
2.5.1 LEA与CEA在大肠癌、大肠腺瘤及正常粘膜中的表达 LEA与CEA的表达主要位于癌细胞腺腔侧的细胞膜表面、腺腔内粘液分泌物和细胞外的粘液中，细胞浆弥漫性分布淡染，见图4。LEA在大肠癌、大肠腺瘤和正常大肠粘膜的阳性表达率分别为84.1%(143/170)（其中高分化腺癌100%、中分化腺癌83.1%、低分化腺癌51.8%）、75.6%(31/41)和14.8%(4/27)。CEA在大肠癌、大肠腺瘤和正常大肠粘膜的阳性表达率分别为88.8%(151/170)（其中高分化腺癌93.8%、中分化腺癌92.3%、低分化腺癌70.4%）、82.9%(34/41)和40.7%(11/27)。LEA的阳性表达率随大肠腺癌组织分化程度降低而下降（χ2=28.21, P<0.01），而且对高分化腺癌表现出更高的选择性。抗CEA单抗对高、中、低分化癌选择性相似(P>0.05)。LEA在大肠癌阳性表达率与正常粘膜相比差异极显著（χ2=59.08，P<0.01）,而与大肠腺瘤相比差异无统计学意义（χ2=1.65，P>0.05）。LEA在腺瘤中的阳性表达率，明显高于正常粘膜（χ2=24.09, P<0.01）。与CEA相比,LEA在大肠癌与大肠腺瘤组织的阳性表达率略低，但无统计学差异（χ2=2.26, P>0.05）。
2.5.2 LEA与CEA表达的关系 LEA与CEA的阳性表达在高分化大肠癌组织之间呈显著正相关（χ2=2.93, P>0.05）,在中分化大肠癌中两者相关性也非常明显(χ2=2.57, P>0.05), 在低分化大肠癌中也很明显(χ2=1.95, P>0.05),在大肠腺瘤中表达迹无差异(χ2=0.31, P>0.05),但在大肠正常粘膜中，LEA与CEA的表达呈显著负相关 (χ2=4.52,P<0.05)。
2.5.3 LEA与CEA在大肠癌诊断中的价值 单独应用LEA与CEA的灵敏度分别为84.1、88.8，特异度分别为48.5、33.8，阳性预测值分别为80.3、77.0，阴性预测值分别为55.0、54.8；平行试验与系列试验的灵敏度分别为95.3、77.6，特异度分别为23.5、55.9，阳性预测值分别为75.7、81.5，阴性预测值分别为66.7、50.0。
3 讨论
肿瘤标志物是由肿瘤细胞生物合成、释放或者是宿主对癌类反应性的一类物质。这种抗原一般仍保持原来细胞的抗原性。在正常细胞不表达或有微量表达，但在肿瘤发生时其含量要明显高出良性肿瘤或正常组织[2]。在这些与肿瘤相关的抗原中很多被作为临床血清肿瘤标志使用[4]。同样,肿瘤标志物也可作为组织或细胞标志物，用免疫化学研究标志物适用于诊断肿瘤或判断肿瘤的预后[5]。CEA是目前应用最广泛的肿瘤标志物。许多上皮性肿瘤均有CEA的表达，同时一些正常上皮细胞亦有CEA表达[6]，因此用于肿瘤的诊断意义不大，但在疗效监测和评估预后中更有意义。ND1抗体经Protein G 柱纯化后，收集活性抗体峰，经间接免疫荧光和ELISA检测其抗原特异性，此单抗能识别大肠癌细胞的表面抗原，证明此抗体与人大肠癌细胞系CCL187具有特异性结合力，而不与HeLa细胞结合；与CEA单抗相比，ND1单抗与CCL187细胞的结合力差异具有统计学意义，说明LEA抗原是一种区别于CEA等其他大肠肿瘤相关抗原，在大肠癌细胞表达更强，这与以前报道相符[3]，同时进一步证明了ND1单抗是高效价、高特异性、高亲和力的抗大肠癌细胞系表面抗原LEA的单克隆抗体。免疫细胞化学染色同样证明ND1抗体能特异地识别大肠癌细胞中的抗原，LEA是比CEA更特异的大肠癌细胞表面相关抗原。本研究中LEA的阳性表达率越低，细胞的分化程度越低，肿瘤的恶性度越高。在高分化大肠癌的阳性表达率高达100%。这与癌细胞分化程度越差抗原性越低有关。表明LEA可能是肿瘤分化的标志。而抗CEA单抗对高、中分化癌的选择性相同，它不受肿瘤分化程度的影响，即使是低分化腺癌亦可呈阳性反应。因此，CEA不能用作良、恶性上皮性肿瘤的鉴别诊断。
A组：LEA和CEA在CLoneA细胞的表达；B组：LEA和CEA在CX1细胞的表达；C组：LEA和CEA在CCL187细胞的表达；D组：LEA和CEA在CCL229细胞的表达
图3 流式细胞仪间接免疫荧光法测定LEA与CEA抗原在大肠癌细胞系的表达（略）
LEA和CEA在大肠癌、大肠腺瘤与正常大肠粘膜中的标记结果显示，LEA和CEA在正常大肠粘膜、腺瘤、大肠癌组织中的阳性率呈递增趋势，腺瘤和大肠癌组织中LEA的阳性表达率与正常粘膜相比有极显著差别。LEA与CEA在大肠癌、大肠腺瘤中的阳性表达率显著高于正常粘膜，可以认为LEA和CEA的高表达与大肠腺瘤和大肠癌的发生发展均有关，大肠腺瘤在恶变过程中可产生和大肠癌相同的肿瘤相关抗原，可能是大肠癌细胞旁分泌作用的结果，与大肠癌的局部浸润和术后复发有重要关系。据报道，在大肠癌中平均只有14.2%～15.5%的病灶中可见到残留的腺瘤组织，且随着癌的浸润发展和肿瘤直径增大，原来存在的腺瘤组织被进一步侵蚀破坏 [7]，所以大肠腺瘤性息肉是大腺癌的癌前病变，大肠癌大多是由大肠腺瘤恶变形成的。从腺瘤发展为癌的时间大约是7～10年[8]。早期发现并及时治疗大肠腺瘤是防止和减少大肠癌发生的理想途径。
本试验中 LEA与CEA在大肠癌、大肠腺瘤中均呈高表达，且两者有明显的相关性，而在大肠正常粘膜中两者表达不相关，因此虽然LEA是有别于CEA的一种新的高分化大肠癌相关抗原，在诊断大肠癌方面两种方法一致。由于肿瘤相关抗原的不均一性，任何一株单抗只能检出部分病例，组合几株单抗才能提高其敏感性[8]。临床上常将几项相关的标志物组成联合标志物组，提高诊断的准确性。单独应用LEA与CEA的灵敏度相似，LEA特异度明显高于CEA 。LEA和CEA在联合检测中采用系列试验虽然提高了特异度和阳性预测值，但假阴性率增高；采用平行试验虽然可提高敏感度、提高阴性预测值，但假阳性率增高。因此联合应用两种单抗的筛检方案价值不大。
大肠癌细胞的恶性表型与其分化程度密切相关。一般认为高分化癌细胞侵袭力低，低分化癌细胞侵袭力强，增殖力高，肿瘤的恶性程度高。从流式细胞仪测定结果中发现，LEA在高分化大肠癌细胞CCL187、CX1、CLone A和CCL229表面表达量均高于CEA(P<0.01)。在低侵袭力大肠癌细胞CX1和CCL187中LEA的表达量均高于高侵袭力大肠癌细胞CLone A和CCL229(P<0.01)，这与组织中检测的结果一致。这个结果提示，LEA可能与细胞分化程度、癌细胞的侵袭力、恶性程度有关，LEA是更加特异的高分化大肠癌相关抗原。LEA可能是一种很有潜力的肿瘤标志物，在大肠癌导向诊断和治疗中，应用ND1单抗可能要比CEA单抗效果好。目前，LEA的血清学诊断方法已经建立[9]。以ND1单抗重组构建的基因工程单链抗体ND1scFV亦显示了良好的体内外特异结合活性 [10]。对此抗原的进一步研究，对指导临床早期辅助诊断和治疗、判断肿瘤恶性程度等有望提供新的途径和方法。
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