作者：周颖，凌斌，高婷，陈敏，冯定庆，程志祥，朱园园，赵卫东，石永云，王梅梅，祝怀平
【摘要】 目的 构建并鉴定Her2特异性siRNA逆转录病毒载体，将其导入SKOV3卵巢癌细胞中，并初步筛选有效抑制Her2表达的细胞株。方法 体外合成含针对Her2特异基因序列的寡核苷酸并定向克隆入逆转录病毒载体RNAiReady pSIRENRetroQ，构建的载体通过测序、酶切鉴定后，脂质体介导下转染到包装病毒细胞株PT67中，嘌呤霉素筛选并挑选细胞克隆，收获病毒上清，将病毒上清转染SKOV3中，经过嘌呤霉素筛选得到稳定抑制Her2表达的SKOV3细胞株，并分别通过RTPCR和免疫组化方法鉴定抑制Her2表达的效果。结果 成功构建了重组逆转录病毒载体，转染包装病毒细胞株获得的病毒上清成功转染了SKOV3， 并且抑制了Her2的表达。结论 抑制Her2表达的SKOV3细胞株的建立，为观察转染siRNA的逆转录病毒表达载体的肿瘤细胞恶性生物学行为变化奠定了实验基础。
【关键词】 Her2；RNA干扰；逆转录病毒载体
Abstract：Objective To establish the stable SKOV3 cell lines with a persistent knockdown of Her2 by transfecting the recombinant retroviral vectors of siRNA specific for Her2 into SKOV3 cell line. Methods We synthesized oligonucleotides for Her2 in vitro, and cloned them into retroviral vector RNAiReady pSIRENRetroQ. Subsequently the plasmids were sequenced and digested to identify the successful construction of the recombinant retroviral vectors. The vectorsbased RNAi were transfected into packing cell line PT67, which was selected by puromycin later. SKOV3 was infected by the virus supernatant of stable PT67 cell lines, and the stable SKOV3 cell lines with a persistent knockdown of Her2 were established by selecting with puromycin, many of which showed significantly reduced levels of Her2 mRNA and p185 by RTPCR and immumohistochemistry methods, compared to wild type SKOV3 cells. Results The recombinant retroviral vectors were constructed successfully, and the stable SKOV3 cell lines with a persistent knockdown of Her2 were established by the infection of virus supernatant secreted by the new stable PT67 cell lines. Conclusion The establishment of stable SKOV3 cell lines with a persistent knockdown of Her2 contributes to the study of the changes of malignant biological activity of tumor cell lines by transfection of siRNA retroviral vector specific for Her2.
Key words：Her2；RNA interference；Retroviral vector
0 引言
Her2基因是人类肿瘤中常发生异常改变的基因之一，它定位于人类染色体17q21，由于其编码的蛋白产物分子量为185KD， 因此其蛋白命名为p185。 p185属于受体酪氨酸激酶（Receptor tyrosine kinase，RTK），过度表达可以赋予卵巢癌、乳腺癌等肿瘤细胞更高的恶性生物学行为，且与肿瘤的化疗敏感性呈显著的负相关［1］，因此抑制p185的表达将有可能降低Her2高表达的卵巢癌细胞的恶性生物学行为, 从而达到治疗卵巢癌的目的，本研究利用RNAi技术的高效性和特异性，选择多种肿瘤中均高表达的癌基因Her2为靶点，用逆转录病毒载体直接在肿瘤细胞内表达siRNA, 从而发挥高效、特异地抑制Her2基因表达的作用，为逆转肿瘤细胞的恶性生物学行为的研究提供了实验基础。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂
逆转录病毒载体RNAiReady pSIRENRetroQ购自BD公司，限制性内切酶MIu I、 BamH I、 EcoR I、 T4DNA连接酶均购自TaKaRa公司；大肠杆菌菌株E.coli DH5α购自上海生工生物工程有限公司；脂质体Lipofect2000、总RNA 提取试剂Trizol购自Invitrogen公司；小剂量质粒提取试剂盒、逆转录试剂盒购自Promega公司；DEPC购自Sigma 公司； TaqDNA聚合酶购自华美生物工程有限公司；上、下游引物由上海生物工程有限公司合成。Her2抗体(鼠抗人单抗)购自北京中杉金桥生物技术有限公司；SP9102 试剂盒为Zymed 公司产品。
1.1.2 细胞株
SKOV3细胞株购自上海细胞所；包装病毒细胞株PT67购自BD公司；细胞培养基DMEM、McCoy’s 5A Medium Modified、新生小牛血清、特级胎牛血清均购自GIBCOL公司。培养液均含有100mg/L的氨苄青霉素和链霉素，37℃、5%CO2饱和湿度下培养。嘌呤霉素购自Invitrogen公司，经生理盐水配成2.5mg/ml，－20℃保存备用。氯喹购自Sigma 公司，经生理盐水配成25mM， 4℃保存备用。聚凝胺(polybrene) 购自Sigma 公司，经生理盐水配成4mg/ml，4℃保存备用。
1.2 方法
1.2.1 目的基因的设计及合成
根据GenBank提供的Her2基因cDNA序列, 通过基因Blast, 挑选长为19bp与21bp的2段Her2特异性寡核苷酸，其序列分别为5′GGACATCTTCCACAAGAAC3′，5′GCTCTTTGAGGACAACTATGC3′, 对照序列为5′GTGCGTTGCTAGTACCAAC3′。合成其发卡样两端配对寡核苷酸链, 用含9个碱基的圈连接起来，分别在5′和3′端引入BamHI与 EcoRI 酶切位点，并在转录终止信号后引入MIuI特殊酶切位点以检验所构建重组载体是否正确。
1.2.2 逆转录病毒载体的构建
将合成的上下链经过变性、复性后形成双链Her2基因siRNA，采用双链定向亚克隆入逆转录病毒载体RNAiReady pSIRENRetroQ，氯化钙转化方法 [2]转化大肠杆菌菌株E.coli DH5α, 氨苄青霉素（100mg/L）筛选出阳性克隆，提取质粒，见表1。表1 Her2特异性发卡样寡核苷酸序列（略）
1.2.3 重组质粒Her2/siRNA的鉴定
用MIu I将重组质粒进行限制性内切酶消化,酶切产物行0.5%琼脂糖凝胶电泳。阳性克隆分别命名为Her2/siRNA1、Her2/siRNA2、Her2/siRNA negtive control，纯化后送到上海生工生物工程有限公司测序鉴定。
1.2.4 重组质粒转染包装病毒细胞株
将包装病毒细胞PT67种到6孔板中，每孔1×105，完全培养基培养12h后用RPMI 1640洗涤2次，更换含25μM氯喹的DMEM培养1h，分别将Her2/siRNA1、Her2/siRNA2、Her2/siRNA negtive control各5μg转染PT67，脂质体Lipofect2000 5μl／孔。转染4h后，更换完全培养基，24h后加入1.875μg/ml嘌呤霉素筛选2～3周。
1.2.5 重组逆转录病毒感染SKOV3
产病毒细胞株PT67达90%汇合后换成无嘌呤霉素的完全培养基，24h后收集细胞上清，经0.45μm滤膜过滤，滤液-70℃保存或立即进行感染。SKOV3培养至对数生长期，弃去原液，加入1ml产病毒细胞株PT67的细胞上清滤液和1.33μg/ml的聚凝胺，37℃、5%CO2条件下培养1h, 重复感染1次, 继续培养24h，更换含1.875μg/ml嘌呤霉素的完全培养基筛选培养,每3～4d换液,约20d后筛选成活的细胞扩增至完全汇合, 以后改用含1.875μg/ml嘌呤霉素的完全培养基培养、传代，细胞株命名为SKOV3/siRNA1、SKOV3/siRNA2、SKOV3/siRNA negtive control。
肿瘤相关抗原在人大肠癌中的表达
RNA干扰Nucleostemin基因对人食管癌Eca109细胞株增殖影