1.2.6 免疫组化
将SKOV3/siRNA1、SKOV3/siRNA2、SKOV3/siRNA negtive control、SKOV3细胞分别接种在含有载玻片的6孔板中，24h后收获细胞爬片，经1×PBS洗涤2次，4％多聚甲醛固定10min，1×PBS洗涤1次，1∶100稀释浓缩原液，滴加在细胞爬片上，4℃过夜。通过北京中杉公司的SAP9102检测试剂盒操作步骤检测一抗，滴加碱性磷酸酶显色剂显色。
1.2.7 RTPCR
分别提取SKOV3/siRNA1、SKOV3/siRNA2、SKOV3/siRNA negtive control、SKOV3细胞的总RNA，取定量好的RNA 1μg，根据Promega反转录试剂盒的步骤合成cDNA，将以cDNA产物稀释5倍。取5μl做模板，以编码区5′、3′端的引物（5′TGCGGCTCGTACACAGGGACTT3′、5′TGCG GGAGAATTCAGACACCAACT3′）扩编码区420 bp ( PCR反应参数：94℃ 变性3min， 94℃ 1min， 56℃ 1min，72℃ 1min，30个循环，72℃ 7min延伸，1% TAE琼脂糖凝胶电泳检测)。同时以引物（5′GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3′、5′CTCCTTA ATGTCACGCACGATTT3）扩增管家基因actin作内对照，产物大小约500bp。（PCR反应参数：94℃变性3min， 94℃ 1min，56℃ 1min，72℃ 1min，30个循环，72℃ 7min延伸，1% TAE琼脂糖凝胶电泳检测）。
2 结果
2.1 酶切鉴定重组质粒
由于插入片断中含有MIu I特殊酶切位点,故只需用单一酶MIu I消化后与未酶切的重组质粒进行对比即可。重组质粒经MIu I酶切后显示出一条6.5kb左右的条带，插入片段由于太小（69bp或73bp）电泳难以显示，见图1。将重组质粒Her2/siRNA1、Her2/siRNA2、Her2/siRNA negtive control送到上海生工生物有限公司测序，测序结果均与目的序列完全相同。表明构建载体成功。
2.2 免疫组化检测p185蛋白的沉默
经免疫组化检测p185蛋白，见图2。载体Her2/siRNA1、Her2/siRNA2均可以有效沉默p185蛋白的表达，以Her2/siRNA2更为明显。
2.3 RTPCR检测Her2基因的沉默
经RTPCR检测Her2 mRNA的表达，载体Her2/siRNA1、Her2/siRNA2均可以有效沉默Her2 mRNA的表达，以Her2/siRNA2更为明显，结论与免疫组化的结果相同，见图3。
3 讨论
癌基因Her2的扩增及其产物p185的过度表达可以赋予肿瘤细胞更高的恶性生物学行为，与多种上皮细胞起源的肿瘤发生关系密切。p185表达与否尚与乳腺癌、卵巢癌、胃癌以及非小细胞肺癌的不良预后有关，也与肿瘤对化疗、生物治疗的敏感性呈明显的负相关，Her2被认为是上皮细胞起源的肿瘤治疗的最有效靶点之一［3，4］。不难理解，探索针对Her2基因或p185蛋白为靶点的有效治疗方法，势必为众多种类恶性肿瘤的治疗寻求一种新的策略。近年来人源化抗p185单抗（Hereceptin）在临床上已经应用于治疗高表达p185的肿瘤患者，显示出较好的疗效 [5]。但是其确切的临床效果尚待进一步的验证，目前对应用Hereceptin争议的焦点在于：①循环血液中可溶性的p185蛋白可影响单抗的疗效；②单抗可能增强肿瘤细胞的侵袭能力［6，7］。为了避免上述治疗过程中的不足，探索更好的肿瘤治疗方法，综合分析国内外有关对Her2基因／p185蛋白文献，本课题选择Her2基因的转录环节—mRNA作为靶点进行干预研究，而非p185蛋白作为靶点，从而在癌基因表达的上游进行干预，以期从源头上抑制了p185蛋白的表达，其效果可能更佳，而且可以避免直接利用抗p185单抗所引起的免疫反应和其他副作用。
RNAi是指在生物体细胞内，外源性或内源性的双链RNA引起与其同源mRNA的特异性降解，抑制其相应基因的表达具有高特异性、高效性、高稳定性等重要的分子生物学特性［8，9］。实验选用的逆转录病毒载体为RNAiReady pSIRENRetroQ，特点是抗嘌呤霉素，质粒产量低，但是转染效率高 [10]。本课题成功建立了沉默Her2基因表达的SKOV3细胞株，RTPCR和免疫组化方法均证明针对Her2基因设计的靶序列构建的载体Her2/siRNA1、Her2/siRNA2能够有效抑制Her2基因的表达，为观察转染siRNA的逆转录病毒表达载体的肿瘤细胞恶性生物学行为变化，并与亲本细胞的生物学行为之间进行比较奠定了实验基础。（本文图2见第318页）
【参考文献】
［1］Slamon DJ, Goldollphin N, Jones LA，et al. Study of the HER2/neu protooncogene in human breast and ovarian cancer [J]. Science, 1989,244（4905）:707712.
［2］J 萨姆布鲁克, DW 拉塞尔.分子克隆实验指南 [M].第3版.科学出版社, 2002.87105.
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［5］Menendez JA, Vellon L, Lupu R. The antiobesity drug Orlistat induces cytotoxic effects, suppresses Her2/neu (erbB2) oncogene overexpression, and synergistically interacts with trastuzumab (Herceptin) in chemoresistant ovarian cancer cells [J]. Int J Gynecol Cancer,2006,16(1):219221.
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［9］YaLin Chiu,Akbar Ali, Chiaying Chu, et al. Visualizing a correlation between siRNA localization, cellular uptake, and RNAi in living cells [J]. Chem Biol, 2004,11(8)：11651175.
［10］Julius MA, Yan Q, Zheng Z，et al. Q Vectors, Bicistronic retroviral vectors for gene transfer [J]. BioTechniques,2000,28(4): 702707.
肿瘤相关抗原在人大肠癌中的表达
RNA干扰Nucleostemin基因对人食管癌Eca109细胞株增殖影