RNA干扰Nucleostemin基因对人食管癌Eca109细胞株增殖影响的实验研究(1)-找论文网

作者：郑学芝，刘桂莲，李丽，孙卫，念红，胡静,蔡子微

【摘要】 目的筛选NS基因特异性siRNA阳性细胞克隆，研究NS基因特异性RNA干扰对Eca109细胞株体外增殖能力的影响。方法用脂质体法将NS特异性siRNA表达载体转染Eca109细胞，Zeocin抗生素压力筛选后用PCR方法鉴定阳性克隆；MTT法检测各组细胞的生长增殖情况，RTPCR方法检测NS基因表达量的变化情况。结果与对照组比较，silencer组肿瘤细胞趋于分化，细胞增殖抑制率超过80%(P<0.01)，差异具有显著性； NS基因表达量下降。结论 NS基因特异性RNA干扰抑制人食管癌Eca109细胞株体外增殖，使NS基因表达量下降。

【关键词】 Nucleostemin（NS）;RNA干扰；食管癌；基因表达；细胞增殖

　　Abstract：Objective To screen NS gene specific positive cell clones,and investigate the effect of human esophagus cancer Eca109 cells proliferation in vitro by NS gene specific RNA interference.Methods The NSsiRNA expression vector was transfected into human esophagus cancer Eca109 cells using LIPOFECTAMINETM2000 Reagent, and positive clones were examined by PCR after stable transfectans screening with Zeocin; detected the cell proliferation by MTT assay and the levels of NS gene expression by RTPCR.Results Compared with the two control groups, the silencer group cells were nearer differetiation,the proliferation inhibitory rate was higher than 80%(P<0.01)；the level of NS gene expression reduced.Conclusion The NS gene specific RNAi can significantly inhibit human esophagus cancer Eca109 cells proliferation in vitro and reduce the level of NS gene expression.

　　Key words：Nucleostemin（NS）; RNA interference; Esophagus cancer； Gene expression; Cell proliferation

　　0 引言

　　NS基因是美国国立卫生研究院的学者Mckay and Tsai 2002年新发现的一种蛋白质核因子［1］，该基因在干细胞及人类的数种肿瘤细胞中表达丰度很高，但在分化的成体组织中，该基因却不表达。二位学者提出干细胞与癌细胞均由相同的蛋白质－NS来决定其细胞自我复制的能力，NS可能是干细胞和肿瘤细胞通过G2/S检验点的特异性调控因子。本文将以人食管癌Eca109细胞株为实验材料探讨NS基因特异性RNA干扰对食管癌Eca109细胞株体外增殖能力的影响。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

人食管癌Eca109细胞购于上海细胞所； 1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶为Gibco公司；PCDNA4/CNSsilencer质粒 [2]；MTT、DMSO、Zeocin、LipofectamineTM2000Reagent：Invitrogen公司;RNA、DNA试剂盒;RTPCR试剂盒：TaKaRa公司;引物合成：上海申能博彩生物科技有限公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养及NS基因转染

　　人食管癌Eca109细胞培养于含10%FBS的RPMI 1640培养基中，置于37℃、5%CO2潮湿空气的CO2培养箱内培养。脂质体法将PCDNA4/CNSsilencer质粒及空载体PCDNA4/Cvector质粒转染 Eca109细胞，分别命名为silencer组、vector组，未转染的Eca109细胞记为normal组。转染细胞进行Zeocin抗生素筛选；阳性细胞克隆继续在含Zeocin抗生素的培养基中进行扩大培养。

　　1.2.2 阳性细胞克隆的鉴定

　　提取克隆细胞基因组DNA，以Zeocin基因为目的基因，通过PCR方法进行细胞克隆外源基因整合阳性鉴定，同时以normal组肿瘤细胞作对照。其引物序列为：上游引物5′atggccaagttgaccagtgc；下游引物为5′tcagtcctgctcctcggcca。 PCR反应条件为：94℃预变性5min，然后 94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，共30循环，最后72℃延伸10min；PCR产物大小约370bp。

　　1.2.3 生长曲线的绘制 [3]

　　将三组细胞传到24孔板上（1×104细胞/孔），每组18复孔，分别于24h、48h、72h、96h、120h、144h用计数板进行活细胞计数，绘出各组细胞的生长曲线。

　　1.2.4 细胞的形态学观察

　　倒置显微镜下观察各组细胞形态变化情况。

　　1.2.5 MTT比色法测定细胞增殖抑制率 [3]

　　在96孔培养板上接种三组细胞，每组24复孔（1×103细胞/孔），分别于24h、48h、72h三个时间段进行MTT测定，以培养液做空白对照并调零，用酶标仪测定490nm处的吸光度值（OD值），每次每组测定8复孔。

细胞增殖抑制率＝1-细胞存活率

即细胞增殖抑制率＝（1-silencer组OD值 / Normal组OD值）×100%

　　1.2.6 各组肿瘤细胞NS基因表达水平检测

　　提取肿瘤细胞总RNA，用RTPCR方法验证各组肿瘤细胞NS基因表达情况。参照genebank中NS和GAPDH的基因序列及参考文献 [4]设计引物如下:NS基因上游P1：5′atgaaaaggcctaagttaaagaaagc，下游P2：5′gctctccaaattctcctttggta；GAPDH上游为P3：5′ggtggacctgacctgccgtctaga，下游P4：5′ttactccttggaggccatgtggg；扩增产物长度分别为570bp和280bp，在同一体系内反应，PCR反应条件为94℃预变性5min， 94℃变性30sec，50℃退火30sec，72℃延伸30sec，共30循环，最后72℃延伸10min。

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