OPCML对卵巢癌细胞抑制的体内外实验研究(1)-找论文网

作者：姚德生,李力, Kenneth Garson, Barbara C Vanderhyden

【摘要】 目的探讨OPCML在体外、体内对卵巢癌细胞的影响。方法将OPCML用重组慢病毒转导入人卵巢癌细胞A2780、OCC1和正常小鼠卵巢上皮细胞CD1。通过细胞增殖试验、细胞聚合力试验、细胞周期的分析和体内成瘤试验等来研究OPCML在卵巢癌细胞中的功能。结果（1）OPCML能被重组慢病毒高效地转导入靶细胞，转导效率几乎达100%，同时达到稳定的表达，Western blot 能检测到OPCML(60kDa)和GFP(27kDa)基因蛋白在靶细胞中的表达；（2）在A2780细胞系，转导入OPCML后的细胞（A2780OPCML）的增殖明显的比未转基因（A2780）或仅转空载体（A2780pWPI）者慢（P<0.01），但在OCC1和CD1细胞系，OPCML对细胞的增殖无明显的影响（P>0.05）；（3）用流式细胞仪法对细胞周期分析显示，OPCML对A2780的细胞周期有明显的滞留作用（P<0.05），但对OCC1、CD1细胞则无明显滞留作用；（4）细胞聚合力试验提示OPCML能明显增强细胞的粘附力；（5）表达OPCML的A2780细胞在裸鼠皮下仅有一个（1/4）有肿瘤生长，体积显著小于A2780及A2780-pWPI组（4/4）（P<0.001），免疫组织化学染色法能够检测到OPCML蛋白在肿瘤组织中的表达。结论慢病毒载体作为转基因的工具，具有高效转导率和稳定表达的特点；OPCML能够增加细胞的粘附能力，抑制A2780的增殖和体内成瘤，提示OPCML可能是一个新的抑癌基因。

【关键词】 OPCML；卵巢癌；慢病毒载体；基因转移；移植瘤模型

　　Key words：OPCML; Ovarian cancer; Lentiviral vector; Gene transfer; Xenograft model

　　0 引言

OPCML (Opioidbinding protein/cell adhesion moleculelike )定位于人染色体11q25，而已有的研究证实在这个区域的杂合子缺失（LOH）与卵巢上皮癌的不良预后相关。因而提示在这个区域可能存卵巢癌的抑癌基因。OPCML与肿瘤的关系目前尚不清楚。我们已经从正常组织中克隆OPCML全长基因，并克隆到了慢病毒载体（Lentiviral vector），为了进一步明确OPCML的功能，本研究利用重组慢病毒将OPCML转导入卵巢癌细胞，研究转基因前后细胞生物学特性的变化。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 细胞及质粒来源

　　人胚胎肾上皮细胞293T、人卵巢浆液性囊腺癌细胞系A2780、人卵巢透明细胞癌细胞系OCC1和小白鼠正常卵巢上皮细胞系CD1均为渥太华大学癌症中心保存和提供，293T、A2780和OCC1均不表达OPCML。质粒pWPIGFP、pCMVdR8.74和pMDG由瑞士Institute of Technology Lausanne由Trono博士惠赠；OPCML表达质粒pWPI-OPCML由本研究组构建。

　　1.1.2 单抗、试剂盒、酶、试剂及引物来源

　　OPCML单克隆抗体由英国爱丁堡大学Eric Miller博士惠赠。兔抗GFP多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，FuGEN6转染试剂盒购自美国Roche公司。山羊抗鸡多抗购自加拿大Abcam公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 重组慢病毒介导的基因转移

　　用磷酸钙沉淀法 [1]将pWPIOPCML+ pCMV.dR874 +pMDG共转染包装细胞293T，获得携带目的基因OPCML和GFP基因的重组病毒(实验组)，同时共转染pWPIGFP+pCMV.dR874 +pMDG进另一组293T作为对照（空载体对照组）。按文献方法 [1]分别获取重组慢病毒，后用之感染A2780、OCC1和CD1细胞系，分别获得表达OPCML和GFP的细胞系A2780OCML、OCC1OPCML、CD1OPCML以及仅携带有荧光蛋白GFP的A2780pWPI、OCC1pWPI、CD1pWPI细胞系。

　　1.2.2 卵巢上皮癌细胞系OPCML基因表达检测

　　1.2.2.1 重组慢病毒介导基因转导效率的检测

　　重组病毒感染48h后，将培养皿放在荧光显微镜下，观察有绿色荧光（GFP）的细胞数，判断感染的效率。同时可用FCM（流式细胞仪）检测GFP阳性细胞百分数：将1×106细胞离心沉淀，用PBS洗2次将细胞重新悬浮于1ml PBS中，尽可能吹打成单个细胞；在流式细胞仪上检测GFP阳性细胞数，验证慢病毒感染效率（转基因效率）。

　　1.2.2.2 采用Western blot检测靶细胞中目的基因蛋白质OPCML的表达

　　重组病毒感染细胞72h后，收集靶细胞蛋白，Western blot检测OPCML蛋白质和标记蛋白GFP的表达。一抗分别为鸡抗OPCML的单体和兔抗GFP的多克隆抗体，二抗为相应的山羊抗鸡或山羊抗兔的多克隆抗体，用微管蛋白 (Tubulin)作为内对照。

　　1.2.3 OPCML对卵巢上皮癌细胞生物行为影响的体外实验

　　1.2.3.1 细胞增殖试验

　　一式三份5×104个对数生长期的细胞A2780, A2780pWPI, A2780OPCML, OCC1,OCC1pWPI, OCC1OPCML，CD1, CD1pWPI, CD1OPCML被分别培养在6孔的培养平板中，72h后用胰酶消化，收集细胞，并吹打成单个细胞，并用自动细胞计数仪计算细胞数，重复3次相同的实验。

　　1.2.3.2 细胞聚合力试验

　　将对数生长期的A2780OPCML细胞及对照组A2780pWPI细胞制成单个细胞悬浮液，将1×106个细胞置于含1ml DMEM的离心管中，于37℃含5%CO2的培养箱中培养。每隔15min，用宽口移液管头吸取30μl培养液，加入30μl苔盼蓝，显微镜下计算单个活细胞数，计算单个细胞所占的百分数；重复3次相同实验。

　　1.2.3.3 细胞周期测定

　　用碘化丙啶染色法，用流式细胞仪按说明操作检测转染OPCML前后靶细胞的细胞周期变化。

　　1.2.4 体内移植瘤形成试验

分别将5×106个A2780、 A2780pWPI、 A2780OPCML（200～400μl）注射到体重相同的雌性CD1裸鼠皮下（每组共四只）；观察肿瘤的形成和进展，4周时，因部分肿瘤太大，结束试验；处死所有的裸鼠，解剖检查肿瘤的形成，测量肿瘤的重量；将移植瘤置于荧光显微镜下，观察绿色荧光GFP表达情况。
　　
　　1.2.5 移植瘤中OPCML蛋白质的表达

采用免疫组织化学ABC法检测，按试剂盒说明操作。

　　1.3 统计学处理

用GraphPad Prism 3.0软件作统计学处理，样本均数的比较用t检验。

　　2 结果

　　2.1 基因转导效率的检测结果

重组慢病毒感染靶细胞48h后，将培养皿放在荧光显微镜下，可以看到几乎100%细胞表达GFP，流式细胞仪检测靶细胞GFP表达，其阳性率达98%以上。

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