2.2 Western blot检测目的基因蛋白OPCML在卵巢癌细胞系中表达结果
Western blo检测显示，重组慢病毒介导的pWPIOPCML转导入靶细胞后，分别能检测到OPCML和GFP蛋白质的表达，而对照组pWPIGFP仅能检测到GFP，无OPCML蛋白表达，见图1。
2.3 OPCML对细胞增殖能力的影响
将OPCML转导入A2780细胞后，细胞增殖速度显著慢于空白组（A2780）和对照组（A2780pWPI）（P<0.01），而空白组和对照组之间无显著性差异（P>0.05）；但在OCC1和CD1细胞系，OPCML对细胞的增殖无明显的影响（P>0.05），提示OPCML能够抑制A2780的增殖，但对OCC1和CD1无明显的抑制作用，见图2。
2.4 OPCML对细胞周期的影响
FCM检测显示OPCML对A2780的细胞周期有明显的滞留作用，转导OPCML后停留在G0～G1期细胞数（75.1%）比转导前的细胞数（66.5%）明显增多（P<0.05），但对OCC1和CD1无明显的滞留作用（P>0.05）。
2.5 OPCML对细胞聚合力影响
细胞聚合力试验显示随着培养时间的增长，单个细胞的数目在A2780-OPCML组显著少于对照组A278-pWPI (P<0.05)，提示OPCML能明显增强细胞的粘附力，有助于抑制肿瘤的转移，见图3。
2.6 OPCML对体内移植瘤生长抑制的影响
注射A2780和A2780/pWPI细胞的4只裸鼠均有肿瘤形成，其重量分别为（280±53）mg和（677±323）mg；而注射A2780/OPCML细胞的4只裸鼠中仅1只有肿瘤形成，其重量仅为10mg。后者在裸鼠体内成瘤重量与前两者分别比较，差异均有统计学意义(P<0.01)，但前两者间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。
2.7 荧光显微镜检测移植瘤中GFP蛋白的表达结果
将转导有pWPIOPCML或pWPIGFP的移植瘤置于荧光显微镜下，仍然可见很强的绿色荧光，而空白对照组A2780形成的肿瘤无荧光，说明被转导的基因能够持久稳定的表达。
2.8 裸鼠肿瘤组织病理学检查及OPCML蛋白表达结果
病理检查显示，形成的肿瘤细胞核大、染色质浓染，可见核分裂象，免疫组织化学染色显示在移植瘤组织细胞中，仍然有OPCML蛋白的表达，定位于细胞膜，提示慢病毒转导的基因能与宿主细胞的DNA整合，随着细胞的分裂遗传到子代，达到持久稳定的表达，见图4。
3 讨论
3.1 OPCML基因对卵巢上皮癌生物学行为的影响
OPCML基因表达的蛋白位于细胞膜，是一个鸦片受体类的细胞粘附因子，广泛存在于神经系统细胞中，在调节鸦片受体和信号传导上具有重要的作用，促进细胞分化以及改变细胞膜性质 [2]。OPCML广泛存在于正常组织和卵巢上皮组织中，在维持正常细胞功能中起着重要的作用，作为一个粘附因子，赋予了细胞间相互黏附的能力 [3]，同时维持细胞的正常分化发育。OPCML基因与卵巢癌的关系，目前知之甚少，但由于其染色体定位区域所发生的杂合子缺失与卵巢上皮癌不良预后相关，因而推测它为肿瘤抑制基因 [4]。2003年Sellar等 [4]首先报道了OPCML与卵巢癌的关系，研究结果显示，OPCML广泛存在于正常卵巢上皮，而在卵巢上皮癌，由于等位基因缺失和甲基化使OPCML失活，可能导致肿瘤的发生，在A2780细胞中OPCML是失活的 [4]。本研究显示，正常OPCML能够抑制A2780细胞的增殖，使A2780细胞周期滞留于G0～G1期；使注射A2780-OPCML细胞的裸鼠体内成瘤率明显下降，肿瘤生长速度明显变慢；能增强细胞的聚合力和粘附力。以上的体内外实验结果进一步证实了以往对OPCML基因作为抑癌基因的推测，表明OPCML基因在卵巢癌的生长、浸润和转移中发挥重要的抑制作用。
OPCML基因抑制肿瘤生长的机制尚不清楚，但在对OPCML基因结构及生物学功能的研究中发现，其序列与酪氨酸激酶生长因子类受体的序列近似，推测OPCML基因有可能通过胞内第二信使的其他途径而发挥作用，如通过胞内的第二信号传导而影响细胞的生长速度和细胞凋亡 [5]。另有学者报道，可能由于等位基因缺失或甲基化而使OPCML基因失活，导致了肿瘤的发生 [4，6]。
但值得注意的是，本研究结果也显示，OPCML基因对病理类型为透明细胞癌的OCC1似乎没有抑制作用，其机制尚不清楚，可能与其遗传背境不一样，突变的基因不同，细胞间信号传导途径不一样有关。临床研究已显示，相对其他病理类型的卵巢癌而言，卵巢透明细胞极易对铂类药物产生耐药，同时预后也差 [7,8]。另外，在体外介导的其他抑癌基因如p53、Barx2与透明细胞癌生长关系的研究也发现，抑癌基因对透明细胞癌系的生长抑制作用明显低于其他病理类型的卵巢上皮癌 [9]。
3.2 重组慢病毒载体介导基因转导的意义
与其他物理或化学转基因方法不同，重组病毒载体基因转移方法具有高效、快速等优点，重组慢病毒载体与重组腺病毒载体不同的是，后者不能感染非分裂期细胞，目的基因不能整合到宿主细胞DNA中而达到稳定表达，而重组慢病毒具有转染效率极高（可达100%），能够感染分裂期细胞及非分裂期细胞，目的基因能整合到宿主的基因组中，并持久稳定地表达，同时具有免疫源性极小、不易产生中和抗体等优点，因而其是目前体内转基因乃至基因治疗最为合适的载体。我们所用的转基因系统中，pWPIGFP为携带目的基因的载体，其带有绿色荧光标志蛋白GFP，可以通过检测绿色荧光标志蛋白GFP间接地反映OPCML的表达，这样可以直接在显微镜下检测活细胞目的基因的转导和表达情况，具有方便、快捷和准确等优点。我们的实验显示，该系统具有极高的转染效果，经二个循环的感染，几乎可使100%的靶细胞获得目的基因，通过荧光显微镜直接观察有否GFP表达从而间接知道靶细胞是否被转染和表达OPCML，大大地简单化了实验过程，其可在2～3天内导入100%的靶细胞，达到稳定表达。因此，为转基因工作研究提供了有效、快捷的工具，同时为今后体内的转基因治疗提供了更为有效可行的工具。（本文图4见第164页）
【参考文献】
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［4］Sellar GC, Watt KP, Rabiasz GJ, et al. OPCML at 11q25 is epigenetically inactivated and has tumorsuppressor function in epithelial ovarian cancer［J］. Nat Genet, 2003, 34(3):337343.
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［8］Lu X, Humeau L, Slepushkin V, et al. Safe twoplasmid production for the first clinical lentivirus vector that achieves >99% transduction in primary cells using a onestep protocol［J］. J Gene Med, 2004, 6(9):963973.
［9］Okuma Y, Kiguchi K, Koshitaka Y, et al. Correlation between expression of oncogene products and resistance to anticancer drugs in cultured ovarian cancer cell lines［J］. Hum Cell, 2003, 16(3):131139.
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