2 结果
2.1 NK细胞的纯度
流式细胞仪检测CD3－CD16+CD56+细胞的纯度达90%以上。
2.2 K562、CNE2细胞表面NKG2D的配体表达
本研究结果显示CNE2细胞表面MICA、MICB、ULBP1的表达率分别为(85.78±4.95)%、(55.13±2.21)%、(51.47±2.43)%，不表达ULBP1、ULBP3；K562细胞表面MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3的表达率分别为(57.12±1.12)%、(46.64±0.40)%、(43.50±0.93)%、(65.24±0.47)%、(53.96±1.24)%，见表1。表1 NKG2D的配体在K562、CNE2细胞表面表达的阳性细胞百分数(略)
2.3 CNE2细胞表面HLAA、B、Cw基因分型结果
CNE2细胞表面HLAA、B、Cw表型为A2,24；B18,35；Cw4,7。
2.4 KIR基因分型
5例健康人均表达KIR2DL1、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2。
2.5 NK细胞杀伤活性
本研究结果显示NK细胞对K562、CNE2细胞的杀伤活性在效靶比5∶1时分别为(29.02±0.45)%、(10.50±2.17)%；效靶比10∶1时分别为(44.43±1.36)%、(27.68±1.47)%；效靶比20∶1时分别为(57.82±1.35)%、(36.99±3.13)%；效靶比30∶1时分别为(71.24±2.36)%、(55.00±2.20)%，在各效靶比时NK细胞对K562细胞的杀伤活性较CNE2细胞明显增强（Ｐ=0.000）；效靶比20∶1时AMO1、BMO1、M295、M310、M551分别对K562细胞表面相应位点进行封闭,NK细胞对K562细胞的杀伤活性分别为(46.82±2.62)%、(49.26±0.98)%、(50.42±1.79)%、(50.75±1.23)%、(51.68±1.34)%和阻断前(57.82±1.35)%相比有显著性差异（Ｐ<0.01）,见图1;效靶比20∶1时AMO1、BMO1、M310分别对CNE2细胞表面相应位点进行封闭,NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性分别为(27.07±2.87)%、(29.12±0.68)%、(27.71±3.18)%与阻断前(36.99±3.13)%相比有显著性差异（Ｐ<0.01）；M295、M551对CNE2细胞表面相应位点进行封闭,NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性分别为(36.67±3.27)%、(36.75±2.53)%，与阻断前相比无明显变化（Ｐ>0.05）,见图2。
3 讨论
NK细胞是机体内重要的淋巴细胞亚群, 在肿瘤免疫中NK细胞构成了第一道杀伤防线。NK细胞表面的抑制性杀伤细胞免疫球蛋白样受体(iKIR）与靶细胞表面特定的HLAI类分子结合可以明显抑制NK细胞的活性，靶细胞缺乏iKIR特定的配体(KIR配体错配)将激发NK细胞对靶细胞的杀伤活性 [1]。不同的iKIR分子识别并结合不同的HLAI类分子。KIR2DL1识别HLACw2、Cw4、Cw5、Cw6；KIR2DL2/2DL3识别HLACw1、Cw3、Cw7、Cw8 ；KIR3DL1识别HLAB w4；KIR3DL2识别HLAA3、A11；其余的KIR配体尚未明确 [3]。KIR2DL1、KIR2DL2/2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2是目前已知的影响NK细胞同种异体反应性的主要抑制性受体 [1]。
NKG2D是1991年Houchins等在NK细胞中发现的，NKG2D除表达在所有NK细胞上外，在绝大多数γδT 细胞、CD8 +αβT细胞上也有表达 [4]。人NKG2D的配体分为两大类：第一类包括MICA、MICB，属于非经典的HLAI类基因，集中表达于胃肠道上皮细胞表面，在大多数上皮性肿瘤细胞如肺癌、乳腺癌、肾癌及卵巢癌、结肠癌肿瘤组织中也有表达。第二类人NKG2D 配体由ULBP1、ULBP2、ULBP3 组成，均带有MHC样α1、α2 结构域，并通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定在细胞表面，其表达较广泛，可以表达于多种细胞、组织、肿瘤，是NKG2D发挥杀伤活性的主要配体。
研究表明，由于肿瘤细胞的MHCI类分子丢失或变异， 使得特异性MHC限制性的细胞毒T细胞不能发挥作用，在这种情况下，识别非MHCI类分子的NKG2D在介导NK细胞识别和溶解肿瘤细胞的免疫反应中发挥关键作用 [5]。NKG2D通过与靶细胞表面诱导产生的相应配体结合，然后结合转接蛋白向NK细胞传递活化信号，使NK细胞获得攻击靶细胞的能力，另外还可能为CD8 +T细胞提供必要的协同刺激信号。在很大程度上NKG2D的活化决定了机体的抗肿瘤细胞免疫水平。
本研究表明CNE2细胞表达MICA、MICB、ULBP2，不表达ULBP1、ULBP3；CNE2细胞表面HLAA、B、Cw表型为A2，24、B18，35、Cw4，7，不表达BW4、A3、A11分子，因此5例健康个体体内表达KIR3DL1、KIR3DL2的NK细胞与CNE2细胞之间存在KIR配体错配现象。有研究表明94%个体表达KIR3DL1，KIR3DL2为NK细胞的框架基因，任意个体的NK细胞均表达KIR3DL2 [6]，因此任意个体的NK细胞均与CNE2细胞之间存在着KIR配体错配现象，结合NKG2D配体的检测结果表明任意个体的NK细胞都存在杀伤CNE2细胞的分子基础。本研究显示NK细胞对CNE2细胞有较高的杀伤活性，antiMICA、antiMICB、antiULBP2均可不同程度地抑制NK细胞对CNE2的杀伤活性，说明NKG2D在NK细胞杀伤CNE2细胞中起主导作用。
K562细胞不表达HLAI类分子，因此任意个体的NK细胞都与之存在KIR配体错配现象，本研究结果表明K562细胞表达MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3。NK细胞对K562细胞具有较高的杀伤活性，antiMICA、antiMICB、antiULBP1、anti ULBP2、antiULBP3均可不同程度地抑制NK细胞对K562细胞的杀伤活性，说明NK细胞杀伤K562细胞通过NKG2D发挥作用。
研究表明 [79]，肿瘤细胞表面NKG2D配体在体内存在膜型和可溶性两种形式，可溶性NKG2D配体与NKG2D的结合可诱导T、NK细胞表面NKG2D的内化和降解，下调NKG2D表达，进而严重损害肿瘤抗原特异性T细胞效应，同时削弱NK细胞的活性，促进肿瘤免疫逃逸。鼻咽癌患者体内是否存在高浓度的可溶性NKG2D配体，能否作为患者的临床预后指标，值得我们进行进一步深入研究。
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