作者：曲颂，朱小东，黎丹戎，张玮，曹骥
【摘要】 目的 探讨不同放射敏感性鼻咽癌细胞株CNE1(鼻咽高分化鳞癌细胞株)和CNE2(鼻咽低分化鳞癌细胞株)中DNA依赖蛋白激酶（DNAPK）的催化亚基DNAPKcs基因的表达与鼻咽癌细胞放射敏感性的关系。方法 通过克隆形成实验测定CNE1、CNE2不同剂量的存活分数，并用线性二次模型拟合剂量存活曲线求出放射生物学参数α、β、SF2、MID值，以及四氮唑蓝比色分析法（MTT法）检测60Coγ线4Gy照射后12h细胞的存活率，以评价两株细胞的放射敏感性。逆转录实时荧光定量PCR技术（RTFQPCR）检测照射前、后不同时间及不同剂量CNE1、CNE2细胞mRNA水平DNAPKcs基因的定量表达。结果 CNE1在各个剂量点的存活分数均比CNE2高，MID值分别为2.78、1.61，SF2值分别为0.627、0.341；4Gy照射后12h的存活率分别为88.2%、72.3%；RTFQPCR显示两株细胞中均有DNAPKcs基因的表达，其相对表达量之比为7.54±2.71（t=4.17，P=0.014），表达差异有统计学意义，DNAPKcs基因在CNE2细胞中存在时间、剂量依赖关系。结论 实验验证了CNE2比CNE1对射线更敏感，DNAPKcs基因的表达与鼻咽癌细胞的放射敏感性有关。
【关键词】 鼻咽癌细胞；实时荧光定量PCR；DNAPKcs；放射敏感性
Abstract：Objective This study was designed to determine the relationship between expression of DNAPKcs gene (a catalytic subunit of DNAPK,which is an important component in NHEJ pathway) and radiosensitivity of nasopharyngeal carcinoma cell lines. Methods Radiosensitivity parameters of nasophryngeal carcinoma cell lines were obtained by the colony forming assay and irradiation dosesurvival curve were done by linear quadratic model. The two cell lines were exposed to 60Coγ ray and received 4Gy, 12 hours later, the survival rate were obtained by MTT assay, and evaluated the different radiosensitivity of two cell lines. After receiving different irradiation dose, the dynamical changes of the expression of DNAPKcs in mRNA level of CNE1 and CNE2 were detected by RTFQPCR. Results Survival rate of CNE1 was higher than those of CNE2 at each dose point. Mean inactivation dose was higher in CNE1(2.78) than that in the CNE2(1.61),and the SF2 was 0.627 and 0.341 respectively. After exposed to irradiation dose of 4Gy，survival rate in CNE1 was also higher than that in the CNE2. The ratio of relative expression of DNAPKcs in the two cell lines was 7.54±2.71（t=4.17，P=0.014）. The expression of DNAPKcs in CNE2 was correlated with the irradiation dose and postirradiation time. Conclusion CNE2 is more radiosensitive than CNE1. The expression of DNAPKcs gene is correlated with the radiosensitivity of nasophryngeal carcinoma.
Key words：Nasopharyngeal carcinoma cell line；RTFQPCR；DNAPKcs；Radiosensitivity
0 引言
放射治疗是治疗鼻咽癌的主要手段，但临床上患者对放射敏感性存在个体差异，因此，放射治疗前即对放射敏感性作预测性分析是目前放射生物学研究的课题之一。DNAPKcs是DNA依赖蛋白激酶（DNAPK）的催化亚基，属于PI3K激酶家族，具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性［1，2］，参与DNA双链断裂缺口的修复。由于细胞的放射敏感性与照射后DNA双链断裂损伤修复的关系密切［3］，近年来已有研究证明DNAPKcs催化亚基可能与肿瘤细胞的放射敏感性有关。本实验通过对不同放射敏感性鼻咽癌细胞株CNE1、CNE2照射前后及照射后不同时间DNAPKcs基因表达的检测，探讨其与鼻咽癌放射敏感性的关系，为临床上从基因水平对NPC放射治疗进行干预提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
CNE1（人鼻咽癌高分化鳞状细胞癌细胞）及CNE2（人鼻咽癌低分化鳞状细胞癌细胞）由本院中心实验室提供，培养条件为含10%小牛血清及青、链霉素的RPMI1640培养基， 5%CO2孵箱37℃孵育。
1.2 照射条件及方法
采用加拿大THERATRONICS780C 60Co远距离治疗机, 剂量率为108 ～111cGy/min，源皮距80cm，调整细胞上方培养液深度为5mm，以此作为60Coγ射线照射所需剂量建成区。
1.3 照射细胞存活曲线
设0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy、16Gy剂量点, 取上述指数生长期细胞，用0.25%的胰酶消化成单细胞悬液细胞消化后制成悬液,以102的密度接种细胞于直径6cm培养皿中,待细胞贴壁后照射。照射后细胞继续培养10～14天，待出现可见集落时终止培养，弃培养液，甲醛固定，姬姆萨染色，计数细胞数>50个以上的集落数，每个剂量点设3个平行样本。计算细胞存活率，计算机按线性二次模型(LQ模型)拟合，绘制细胞存活曲线，求PE、α、β、SF2、MID值。
1.4 MTT法检测单次照射后细胞存活率
96孔板接种细胞,每孔104个,每个时间点设6孔，培养48h后单次照射4Gy。未照射和照射后细胞在5%CO2 孵箱37℃孵育后，分别于照射后3、6、12、24、36、48h以10∶1的体积加MTT (5mg/ml)，作用4h后吸弃培养液，每孔加0.2ml的DMSO使细胞裂解,37 ℃孵育待紫色固体凝粒溶解均匀后，酶标仪测OD490值。用各时间点的OD值除以培养48h未照射对照组的OD值得到各时间点的存活率。
1.5 细胞总RNA抽提及cDNA制备
取上述对数生长期细胞，以105的密度接种于100ml培养瓶中，行0～16Gy照射后12h采用小量柱离心式细胞总RNA抽提试剂盒（上海华舜生物工程有限公司）提取细胞总RNA，具体操作步骤详见说明书。按照MMLV 反转录试剂盒（MBI公司）说明书操作合成cDNA 模板。
1.6 引物的设计与合成
根据GenBank中GAPDH和DNAPKcs的mRNA序列，由Primer 3在线设计，上海生工生物技术有限公司合成，各引物序列设计如下：GAPDH（GI：7669491）F：5′GAAGATGGTGATGGGATTTC3′，R：5′GAAGGTGAAGGTCGGAGT3′，扩增片断长度225bp；DNAPKcs(GI：13570016)F：5′ATCTCTTAAAGCGGGCCTTCG3’，R：5′AGGCATCAACTCAGGGACTGG3′，扩增片断长度239bp。
1.7 逆转录荧光定量聚合酶链反应（RTFQPCR）
采用iCycler iQTM实时PCR检测仪(BIORAD公司)进行PCR 扩增及结果分析。用未经照射的CNE2细胞的cDNA制备标准品，等比稀释为100、101、102、103、104、105浓度。反应体系25μl：10×PCR Buffer 2.5μl、MgCl2 2μl、dNTP 2μl、Taq DNA聚合酶(大连宝生物工程有限公司) 2U、上、下游引物各10pmol、20×SYBR Green I染料（上海捷瑞生物工程有限公司）1μl及cDNA 1μl。将上述成分混匀后,于PCR仪上进行扩增, GAPDH和DNAPKcs的扩增条件为94 ℃变性30s，67℃退火30s，72 ℃延伸45s。共反应40个循环,在每一循环的退火温度时收集荧光进行实时检测。所用荧光的激发波长为488nm，发射波长为520nm。在PCR 后进行熔解曲线分析以确定得到的产物是否为目的产物，温度以0.5℃/10s的速率从50℃缓慢递增到100℃，相当于在520nm处连续测定样品的荧光强度以获取熔解曲线。
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