1.8 统计学处理
采用SPSS11.5统计软件包，照射前CNE1、CNE2细胞DNAPKcs相对表达量的结果采用两组均数的t检验，4Gy照射后不同时间及0～16Gy照射后12h的相对表达量采用Spearman等级相关分析。
2 结果
2.1 细胞存活曲线
由线性二次模型(LQ模型)拟合的剂量存活曲线见图1，CNE1、CNE2细胞的放射生物学参数α（Gy1）值分别为0.059、0.323，β（Gy2）值分别为0.068、0.071，SF2值分别为0.627、0.314，MID（Gy）值分别为2.78、1.61，可知CNE2细胞的内在放射敏感性明显高于CNE1细胞。
2.2 4Gy照射后不同时间CNE1、CNE2细胞存活情况
4Gy照射12h后CNE1细胞存活率为88.2%，CNE2细胞存活率为72.3%，经t检验有显著差异（t=5.759，P=0.005），见图2。结合结果1说明：照射后CNE2细胞无论是间期死亡还是增殖死亡均较CNE1细胞增加，CNE2细胞较CNE1细胞对射线更敏感。
2.3 RTFQPCR实验结果
通过琼脂糖凝胶电泳验证扩增产物的特异性，见图3，结合熔解曲线分析可知DNAPKcs在CNE1、CNE2细胞中均有表达，见图4。结果显示CNE1细胞的DNAPKcs相对表达量为CNE2细胞的7.54±2.71（t=4.17，P=0.014），从图5、6可见0～16Gy照射后12h及4Gy照射后不同时间CNE1、CNE2细胞中DNAPKcs相对表达量的变化，其中CNE2细胞的DNAPKcs表达具有时间和剂量依赖关系（相关系数分别为0.945、0.983，P=0.005、0.001）。
3 讨论
放射线导致细胞损伤的主要靶点是DNA，由放射线的直接作用和电离效应产生的自由基共同导致的DNA单链和双链断裂损伤，其中以DNA双链断裂（DSB）损伤最为重要。DSB可通过同源重组或非同源末端连接（NHEJ）实现修复，DNAPK是哺乳动物细胞中参与NHEJ主要的分子途径之一，是由Ku70、Ku80以及DNAPKcs三亚基组成，其中Ku70、Ku80组成Ku蛋白调节亚基［4］，在DSB修复中起着辨认、结合和排列DNA末端并招募催化亚基DNAPKcs的作用，任意一个组分缺陷均会导致DNAPK活性丧失，而导致放射敏感性增加。国内外已有文献报道用针对DNAPKcs的反义核酸可提高胶质瘤细胞、Hela细胞的放射敏感性 [5，6]。
Beamish等 [7]研究发现DNAPKcs基因突变将导致小鼠产生重症联合免疫缺陷病，细胞对电离辐射敏感性增加。有的研究表明DNAPKcs表达缺陷的胶质瘤细胞对放射线敏感，而其正常表达的胶质瘤细胞则对射线抗拒 [8]。以上均说明了DNAPKcs与放射敏感性有着密切的联系。为了研究DNAPKcs基因的表达是否与鼻咽癌放射敏感性有关，我们首先采用克隆形成实验并由线性二次模型(LQ模型)拟合剂量曲线，验证了本实验室保存的CNE2（人鼻咽低分化鳞癌细胞株）的放射敏感性高于CNE1（人鼻咽高分化鳞癌细胞株），通过RTFQPCR的方法检测两株细胞中DNAPKcs基因的表达差异及与时间、剂量的依赖关系，发现DNAPKcs在CNE2中的表达明显高于CNE1，此外DNAPKcs在CNE2细胞中还存在与剂量和时间的依赖关系，即随着照射剂量的增加和单次照射后时间的增加其表达量也增加。为何DNAPKcs只在CNE2细胞株中存在剂量与时间的依赖关系，这是我们所要解释的问题，分析原因有以下几种可能性：其一，DNAPKcs在CNE1细胞中表达量较高，其表达量不因DNA损伤出现较大的波动；其二，DNAPK是p53的上游激活因子 [9]，可能与p53所处的功能状态有关，而本实验尚未对此进行深入研究；其三，目前只从mRNA水平检测DNAPKcs的表达，尚未得到蛋白水平表达差异的证据；其四，可能还存在其他调控因素的协同作用。
综上所述，笔者认为DNAPKcs是决定鼻咽癌DNAPK功能比较重要的亚基，其催化功能在射线照射后引起的DSB修复中发挥着较为重要的作用，调控着DNAPK的活性，可为早期筛选放射敏感的鼻咽癌患者以及对鼻咽癌进一步的放疗增敏临床研究提供可靠的理论依据，有关DNAPKcs与鼻咽癌放射敏感性的关系还需要进一步的深入研究来证实。
【参考文献】
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[2] Bailey SM，Brenneman MA，Halbrook J，et al.The kinase activity of DNA PK is required to protect mammalian telomeres [J]. DNA Repair (Amst), 2004, 3(3): 225233.
[3] McKay MJ, Kefford RF.The spectrum of in vitro radiosensitivity in four human melanoma cell lines is not accounted for by differential induction or rejoining of DNA double strand breaks [J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys，1995，31(2):345352.
[4] Jeggo PA.Identification of genes involved in repair of DNA doublestrand breaks in mammary cells [J]. Radiat Res，1998，150(suppl)：580591.
[5]Daido S，Yamamoto A，Fujiwara K，et al. Inhibition of the DNAdependent protein kinase catalytic subunit radiosensitizes malignant glioma cells by inducing autophagy [J].Cancer Res，2005，65(10):43684375.
[6] 余子建，孙敬芬，隋建丽，等.DNAPKcs反义核酸增强HeLa细胞对辐射及化疗药物顺铂的敏感性 [J].中国现代医学，2005，15(8)：11481151.
[7]Beamish HJ，Jessberger R，Riballo E，et al.The Cterminal conserved domain of DNAPKcs，missing in the SCID mouse, is required for kinase activity [J]. Nucleic Acids Res,2000,28(7):15061513.
[8] Ai R，Sandoval A，Labhart P. Different Differential gene expression in human glioma cells:correlation with presence or absence of DNAdependent protein kinase [J]. Gene Expr，2003，11(1)：3545.
[9] Woo RA，McLure KG，LeesMiller SP，et al.DNAdependent protein kinase acts upstream of P53 in response to DNA damage [J].Nature，1998，394 (6694):700704.
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