1.5 流式细胞术检测细胞凋亡 以0.25%胰蛋白酶消化后，锥虫蓝拒染法计数细胞，使收集细胞总数为1×106以上，1 500ｒ/min离心5min后，弃上清，转入1.5ml Eppendorf管内，加入冰PBS(pH7.4)缓冲液，1 500ｒ/min离心5min后，再洗1次，弃上清，缓慢加入20℃预冷的70%乙醇1.5ml，固定细胞，充分震荡，使细胞分散，加入碘化丙啶(PI)和Annexin VFITC 2种染料，各5μl，4℃保存15min后，放入流式细胞仪的样品室，采用488nm氩离子激光进行检测。
1.6 流式细胞术检测细胞周期 同上收集2×105～1×106细胞，75%冷乙醇固定10min。RNA酶消化，加碘化丙啶染液，4℃避光静置15min。用流式细胞仪进行检测。
1.7 统计学方法 采用Excel软件中的方差分析和ｔ检验进行统计学处理，以α=0.05作为检验标准。
2 结果
2.1 经CsA处理24h的肝癌细胞OD值较对照组无明显变化，作用48h后OD值较对照组明显降低（P<0.05），表明经CsA处理48h的肝癌细胞增殖能力明显受到抑制，见表1。表1 不同浓度CsA对HepG2肝癌细胞 *：与对照组比较P<0.052.2 CsA在5～1 000μｇ/L对HepG2肝癌细胞作用48h影响随浓度增加,凋亡率逐渐增加，超过该浓度时, 则出现凋亡率减低，见表2。
2.3 CsA 在200μｇ/L时对HepG2肝癌细胞作用48h影响与对照组比较，CsA使 G2/M期显著延长，对S期影响不大；单用ADM使S期显著缩短和G2/M期延长。说明二者对细胞周期影响为主要阻滞于G2/M期。CsA联合ADM应用显示CsA与 ADM对G2/M期的阻滞有无协同作用。CsA在500ng/ml对HepG2肝癌细胞有促进细胞凋亡作用，与ADM有协同促调亡作用。表2 不同浓度CsA对HepG2肝癌细胞凋亡影响 *：与对照组比较P<0.05；Δ：与ADM组比较P<0.05
3 讨论
尽管肝癌肝移植患者术后面临高复发率的风险，但在一部分患者中，肝移植却获得了良好效果，甚至长期生存。Cherqui等[1]研究显示即使癌灶>5ｃｍ的患者移植术后1、3年无癌生存率分别达70%和56%,与小肝癌组移植术后生存率相近。CsA作为肝移植术后基本的免疫抑制剂，他们对肝癌的生物学影响及其与化疗合理应用有待深入研究。
我们研究表明CsA对肝癌细胞作用24h，尚无明显的细胞抑制，当作用48h，肝癌细胞增殖能力显著受到抑制，不同浓度之间无显著差别。CsA对凋亡影响却表现明显的量效关系，低浓度时凋亡增加，达一定浓度后，凋亡率骤降，呈双向作用。表明细胞生长抑制除与凋亡有关，尚有其他机制，如直接造成肝癌细胞的坏死。
ADM作为一种化疗药物,既可以直接杀伤细胞致其坏死,又可以诱导其凋亡,其机制大体有以下几点:(1)ADM进入细胞后很快与细胞核结合,一部分与线粒体和微粒体结合,它们形成的复合物可导致DNA、RNA和蛋白质合成受抑,DNA双螺旋不能卷曲,DNA链易于折断，DNA一旦受损,则不易修复[2]；(2)合适浓度时则诱导细胞凋亡;随其浓度的增加,凋亡细胞百分率逐步增加，若浓度继续增高,凋亡率则不再增加,而坏死细胞逐渐增多[3]。钟雪云等[4]研究报道了阿霉素诱导肝癌细胞凋亡的阈值的研究，超过该值时，才表现凋亡率的显著增加。
我们研究发现CsA及ADM二者对细胞周期影响为主要阻滞于G2/M期。CsA对HepG2肝癌细胞有促进细胞凋亡作用，与ADM有协同促调亡作用。G2期细胞的主要特征是RNA的合成和染色质的螺旋化,此期细胞对外界环境敏感,易受各种因素的影响[2]。这为联合作用于G2期的化疗药（阿霉素），协助肝癌治疗提供了依据。我们实验表明CsA联合ADM对体外肝癌细胞治疗有协同作用。CsA是一种免疫抑制剂，在临床肝癌肝移植术后应用CsA联合ADM对肝癌复发转移的影响，有待进一步动物实验和临床研究证实。
【参考文献】
［1］ Cherqui D. Role adjuvant treatment in liver transplantation for advanced hepatocellular carcinoma［J］. J Hepatobiliary Pancreatic Surg,1998,5（1）:3540.
［2］ 张覃沐.抗肿瘤药物的药理与临床应用［M］.第1版.郑州:河南医科大学出版社,1999.163.
［3］ Bonfoco E, Krainc D, Ankarcrona M, et al. Apoptosis and necrosis: Two distinct events induced, respectively, by mild and intense insults with Nmethyldaspartate or niyric oxide/superoxide in cortical cell culture［J］. Proc Nati Acad Sci USA,1995,92（16）:71627166.
［4］ 钟雪云，陈运贤，孙晓东.顺铂与阿霉素诱导肝细胞肝癌细胞凋亡阈值研究［J］.中国病理生理杂志,2000，16（3）：199202.
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