2 结果
2.1 抗肝癌hdsFvRCRNase融合蛋白的表达及纯化
经0.1mmol/L IPTG在30℃诱导4h，抗肝癌hdsFvRCRNase融合蛋白以可溶性蛋白形式表达在细菌上清中。融合蛋白碳末端含有6×His标签蛋白，经NiNTA Agarose亲合层析法纯化后，蛋白纯度达到基本均一，见图1。
1:Uninduced; 2:Low molecular protein marker;3: Total protein of induced;4:Supernatant of induced; 5:Precipitation of induced; 6:Purified product
图1 抗肝癌hdsFvRCRNase的表达及
纯化的SDSPAGE分析
2.2 抗肝癌hdsFvRCRNase抗原结合活性
免疫细胞化学染色。结果显示，反应阳性的棕黄色颗粒特异性地定位于肝癌细胞的细胞膜上，少数存在于细胞浆中，见图2，这一结果与亲本抗体的实验结果相一致，而阴性对照及无关抗体对照结果均呈阴性，说明hdsFvRCRNase具有亲本抗体的特异性和亲和性。
2.3 抗肝癌hdsFvRCRNase的杀伤活性
MTT检测结果显示hdsFvRCRNase对肝癌细胞具有明确的杀伤活性，IC50为6.8μg/L，且随着免疫毒素浓度增加，杀伤率逐渐提高，而正常肝细胞HL02的生长则不受影响，初步说明hdsFvRCRNase对肝癌细胞具有一定的杀伤作用，见图3。
2.4 抗肝癌hdsFvRCRNase的稳定性
纯化的hdsFvRCRNase稳定性检测结果显示，hdsFvRCRNase仍能保持其生物学活性无明显下降，表明免疫毒素确实具有较强稳定性。
图3 抗肝癌hdsFvRCRNase免疫毒素的杀伤活性检测
3 讨论
RCRNase属于核糖核酸酶（Ribonuclease,RNase）超家族[5,6]。许多研究表明，RNase超家族不仅具有催化功能，而且具有细胞毒性，表现出强大的抗肿瘤作用。由于它们能够特异性杀灭恶性肿瘤细胞，因此有望成为一类新型的抗肿瘤药物[7,8]。细胞毒性RNase分子量小，且它们中的一些成员来自于人体，作为重组免疫毒素的弹头物质制备基因重组免疫毒素，不但可增强杀伤恶性肿瘤细胞的活性，而且与传统植物或细菌毒素免疫毒素相比，免疫源性低，穿透力强，在肿瘤导向治疗中显示出巨大的应用前景。有人将RNaseA与表皮生长因子融合制备的重组免疫毒素，经体外细胞毒实验证实对表达表皮生长因子受体的肿瘤细胞具有特异性杀伤作用[9]。Deonarain等[10]研究表明制备BSRNase单链重组免疫毒素不但可显著增强抗肿瘤效果，而且大大降低毒副作用。
近二十年来，抗体的研究经历了多克隆抗体、单克隆抗体和基因工程抗体三个阶段的发展过程，其中基因工程抗体scFv具有分子量小，特异性强，亲和性高等优点是目前较为理想的免疫毒素的载体。通过二硫键稳定制备的dsFv比scFv稳定性强，表达产量高，在动物实验中dsFv免疫毒素表现出更好的抗肿瘤活性[11,12]。在多年研究中，我们先后制备了特异性强、亲和力高的抗肝癌单克隆抗体[13]，通过基因工程改造后获得的鼠scFv基本保持亲本抗体的特异性和亲和性，荷瘤裸鼠实验证明，鼠scFv免疫毒素对肝癌具有明确的导向治疗作用[14]。为了降低免疫源性和增强稳定性，经人源化和二硫键稳定制备了hdsFv，4℃放置3个月活性基本保持不变[15]。在过去研究基础上，我们构建并表达了抗肝癌hdsFvRCRNase免疫毒素，通过在表达质粒中引入硫氧还蛋白基因和6×His基因，实现了免疫毒素在大肠杆菌中的可溶性表达，经过简单复性及亲合层析纯化等步聚，获得了对肝癌细胞具有特异性结合活性、稳定性强，具有一定杀伤作用的抗肝癌重组免疫毒素。
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