白英提取物的免疫调节作用研究(1)

          作者：谢永芳，梁亦龙，舒坤贤 ，张继承，袁帅

【关键词】  白英；,,免疫调节

　　摘要：目的探讨白英提取物的免疫调节作用。方法实验设3个浓度的药物组和空白对照组，对其进行正常小鼠脾淋巴细胞转化实验、迟发型变态反应、NK细胞活性测定、抗体生成细胞的检测、腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞、碳廓清实验等实验。结果各项免疫学活性测定表明白英提取物能有效地增加正常小鼠的脾淋巴细胞转化率，增强小鼠迟发型变态反应、NK 细胞活性、抗体形成细胞活性、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞百分率，且随提取物溶液浓度增高而增强。结论 白英提取物具有一定的免疫调节作用。

　　关键词：白英；  免疫调节

　　Effect of Solanum lyratum Thunb. Extract on Immune Regulation

　　Abstract:ObjectiveTo investigate the immunoregulation effect of Solanum lyratum Thunb. extract. MethodsThree concentrations of Solanum lyratum Thunb. extract and a control group were divided. The Immune function of Solanum lyratum Thunb. extract was studied on normal mice through the following indices：splenic lymphocyte transformation efficiency，delayed type allergy，NK activity，antibody―forming cells(Arc)activity，rate of carbon clearance，and rate of peritoneal macrophage phagocytizing chicken red blood cell(CRBC).ResultsIt was found that Solanum lyratum Thunb. extract increased splenic lymphocyte transformation efficiency,enhanced delayed type allergy，NK activity, AFC activity，the rate of carbon clearance,and the rate of peritoneal macrophage phagocytizing CRBC. ConclusionSolanum lyratum Thunb. extract possesses a potential effect of immune regulation．

　　Key words:Solanum lyratum Thunb.；  Immune regulation
   
　　白英Solanum lyratum Thunb.系茄科植物，性味苦、辛、微寒，归肝、胆经，商品名称“白毛藤”“蜀羊泉”。具有清热解毒、祛风化痰、利湿退黄、抗癌的功能，为常用抗癌中草药。临床多用于肺癌、消化道癌、宫颈癌、绒毛膜上皮癌等多种癌症，此外还用于湿热黄疸、痢疾、肾炎、咽喉肿痛、关节炎等［1］。单长民等［2］研究发现白英脂溶性提取物具有诱导人肝肿瘤细胞BEL7404产生凋亡的作用。施文荣等［3］研究表明白英水提液对HL60肿瘤细胞既表现为短时间作用后的细胞杀伤，也表现为药物持续作用后的增殖抑制。至今未见有关白英提取液具有提高免疫功能的报道。本文通过小鼠脾淋巴细胞转化实验、迟发型变态反应、NK细胞活性测定、抗体生成细胞的检测、腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验、碳廓清实验等方法对白英提取物的免疫学活性进行研究，以期为白英的开发应用积累有价值的资料。

　　1   材料

　　1.1   材料 白英（采于重庆南山）。以75％乙醇提取后，再以乙酸乙酯萃取，获得白英脂溶性提取物。DMSO溶解后以细胞培养基稀释至适宜浓度供实验用。昆明种小鼠，18～20 g，购于重庆中药研究院。

　　1.2   仪器 CO2培养箱，紫外可见分光光度计，打孔器，酶标仪，倒置显微镜，隔水式电热恒温培养箱，电子天平，离心机等。

　　2  方法

　　2.1  白英提取物对正常小鼠免疫功能的影响

　　2.1.1  小鼠脾淋巴细胞转化实验昆明种小鼠24只，随机平均分成4组，每组6只，除对照组外，其他3组为提取液溶液低、中、高剂量组，浓度分别为2.5，5，10 mg/ml，每鼠均腹腔注射0.2 ml,对照组注射等量生理盐水。连续注射15 d后，引颈法处死小鼠，无菌制备脾细胞悬液，通过200目钢丝网，用Hanks液清洗后，用RPMI 1640(10 胎牛血清及20 g/ml PHA)1 ml制成脾淋巴细胞悬液(1×106/m1)37℃ ,5% CO2培养48 h后,离心5 min，取细胞涂片,瑞氏染色。观察计数，计算出脾淋巴细胞的转化百分率。

　　2.1.2  小鼠迟发性变态反应(耳肿胀法)二硝基氟苯(DNFB)诱导。称取DNFB 50 mg,置洁净干燥小瓶中，加预先配好的丙酮麻油溶液(丙酮∶麻油= 1∶1) 5 ml，密塞后胶布封口。混匀、制得DNFB 溶液(临用前配制,用250 μl注射器通过瓶盖取用) 。昆明种小鼠24只，体重18～20 g，随机平均分成4组，每组6只，连续灌胃至第20天，每鼠腹部皮肤用硫化钡脱毛，范围约3 cm2 ，用50 μl DNFB溶液均匀涂抹于右耳两面进行攻击。攻击24 h后，颈椎脱臼处死小鼠,每鼠用打孔器取下直径8 mm的左、右耳片称重。

　　2.1.3   NK 细胞活性测定［4］ 取小鼠24 只,随机分成4 组,连续灌胃30 d 后，颈椎脱臼法处死，无菌取脾，以新鲜传代的YAC1细胞为靶细胞,以无菌新鲜制备的脾单细胞悬液为效应细胞。取靶细胞和效应细胞各100 μl，效应细胞和靶细胞个数比为50∶1 ,取YAC1细胞和脾效应细胞各100 μl，加入96孔培养板中，YAC-1细胞自然释放孔加YAC1细胞和培养液各100 μl，YAC1细胞最大释放孔加YAC1细胞和1% NP40各100 μl，上述各项均设3个复孔，于37℃，5 % CO2培养箱中培养4 h，离心5 min，每孔吸取上清液100 μl置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100 μl，反应3 min，每孔加入1 mol/L 的HC 130 μl，在酶标仪490 nm处测定光密度值。按下式计算NK细胞自然杀伤率：自然杀伤率( %)=(样品释放平均D值-自然释放平均D值)／(最大释放平均D值-自然释放平均D值)×100%。

　　2.1.4   抗体生成细胞的检测［5］  昆明种小鼠24只，分组如前，除对照组外，其他3组为白英提取液低、中、高剂量组，腹腔注射，剂量同前，对照组注射等量生理盐水，连续注射10 d后，取脾脏，200 目筛网过滤，用Hanks 液洗3 次,每次1 500 r/ min 离心10 min ，将细胞悬浮于5 ml RPM 1640 培养液中。将表层培养基加热溶解,45 ℃水浴保温,与等量2倍浓度Hanks 液混合,分装小试管,每管0.5 ml ，加入50 μl 10% SRBC ,20 μl 脾细胞悬液,混匀,制片,二氧化碳培养箱中培养1 h ,加入用SA 缓冲液稀释的补体(1∶10) ,继续培养1 h ,计数溶血空斑数。

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